PPGCFAR - Mestrado em Ciências Farmacêuticas (Dissertações)

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Análise do comportamento proliferativo de uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae por citometria de fluxo
(UFVJM, 2017) Rodrigues, Camila Cristina; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Duarte, Rinaldo; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Duarte, Rinaldo; Santos, Alexandre Soares dos; Cardoso, Valéria Macedo
As leveduras do gênero Saccharomyces, em especial as da espécie Saccharomyces cerevisiae, são microrganismos eucarióticos unicelulares do Reino Fungi. Possuem um papel importante em processos de fermentação, como na utilização para a produção de bebidas alcoólicas e pães, sendo considerados micro-organismos seguros para alimentos. O monitoramento das matérias-primas e da proliferação de leveduras é uma necessidade para o sucesso do processo fermentativo. Nesse sentido, a citometria de fluxo, que é um método rápido e preciso, pode se apresentar como ferramenta promissora no campo da fermentação e no controle de bioprocessos. Assim, o objetivo desse trabalho foi realizar a análise do crescimento e heterogeneidade populacional de uma linhagem comercial de Saccharomyces cerevisiae pela técnica de citometria de fluxo. Para isso foi utilizada a marcação intracelular com o fluorocromo éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína. A suspensão de levedura incorporada com o fluorocromo foi transferida para tubos de ensaio contendo 10 mL de YEPD e incubada a 25º C e foram analisadas, após diferentes tempos, por citometria de fluxo, microscopia confocal e espectrofotometria. Os resultados demonstraram que foi possível observar, por citometria de fluxo, alterações morfológicas da linhagem Saccharomyces cerevisiae ao longo do tempo, bem como quantificar o decaimento da fluorescência do corante CFSE após sucessivos processos mitóticos. Por essa técnica também foi possível mensurar o número de células da linhagem estudada ao longo do processo de multiplicação comparando-se às outras metodologias comumente utilizadas para este fim. Conclui-se com esse estudo que a citometria de fluxo mostrou-se como uma ferramenta confiável e sensível para a análise do crescimento e heterogeneidade populacional de Saccharomyces cerevisiae.
Caracterização bioquímica de peroxidase da abobrinha (Cucurbita pepo)
(UFVJM, 2019) Santos, Emylle Thayssa Mendonça; Cardoso, Valéria Macedo; Thomasini, Ronaldo Luis; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Cardoso, Valéria Macedo; Thomasini, Ronaldo Luis; Carneiro, Guilherme; Morais, Harriman Aley; Molina, Gustavo
As peroxidases podem ser obtidas de vários vegetais, como batata doce, rabanete, pepino, entre outros. A raiz forte (HRP) é a principal fonte comercial de peroxidase sendo geralmente cultivada em países de clima frio. No entanto, o alto custo da HRP restringe sua aplicação. A abobrinha (Cucurbita pepo) é um vegetal amplamente cultivado no Brasil, sendo relativamente acessível e de baixo custo, podendo vir a ser uma fonte promissora de peroxidase. Portanto, o objetivo deste estudo foi extrair, purificar e caracterizar a peroxidase produzida pela abobrinha (Cucurbita pepo) para avaliar a viabilidade desta fonte enzimática. O extrato bruto da casca e do fruto da abobrinha sem a casca foi obtido usando tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7, sendo posteriormente precipitado com sulfato de amônio e aplicado a cromatografia de exclusão em gel. A peroxidase proveniente da casca da abobrinha apresentou maior atividade, concentração de proteína, atividade específica e rendimento que a enzima proveniente do fruto da abobrinha sem a casca. O processo de purificação demonstrou ser eficiente resultando em uma alta atividade específica (11,109 U.mg-1). A presença da peroxidase no gel, após eletroforese, foi confirmada pela presença de duas bandas com pesos moleculares de aproximadamente 50 kDa e 60 kDa, sugerindo a existência de duas isoenzimas. A enzima apresentou pH e temperatura ótimos na faixa de 7,0 a 8,0 e entre 25 ºC e 30 ºC, respectivamente. A estabilidade máxima ocorreu na faixa de pH entre 6,0 e 8,0, a 30 °C. A enzima demonstrou alta afinidade pelo guaiacol e também pelo peróxido de hidrogênio, apresentando Km de 4,68 mM e 4,76 mM, respectivamente. A enzima foi ativada na presença de Cu2+ e Fe3+ nas concentrações de 1 mM, 5 mM e 10 mM e Mn2+ e Ca2+ nas concentrações de 1 e 5 mM. A peroxidase de abobrinha não sofreu ativação pelos solventes orgânicos testados. O estudo possibilitou a obtenção da peroxidase extraída de uma fonte vegetal extremamente acessível, utilizando método de extração simples, rápido e econômico. Os resultados sugerem que a abobrinha pode ser uma fonte promissora para a obtenção de peroxidase a ser utilizada em várias aplicações como em diagnóstico, detoxificação de efluentes, tecnologia de alimentos, entre outras áreas.
Otimização da produção da enzima anti-leucêmica L-asparaginase por Penicillium sp.
(UFVJM, 2017) Ardila, Jorge Andrés Rueda; Vanzéla, Ana Paula de Figueiredo Conte; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Vanzéla, Ana Paula de Figueiredo Conte; Grazziotti, Paulo Henrique; Cardoso, Valéria Macedo
A enzima L-asparaginase é atualmente utilizada na indústria de alimentos e na indústria farmacêutica devido à facilidade de catalisar a reação de hidrólise da L-asparagina em aspartato e amônia. Esta propriedade tem aplicação na indústria dos alimentos, pois evita a produção de compostos carcinogênicos como as acrilamidas. Por outro lado, na indústria farmacêutica, esta reação enzimática detém o crescimento de células leucêmicas devido à falta de L-asparagina que estas células devem afrontar. Conforme as células leucêmicas têm pouca ou nenhuma asparagina sintetase, as rotas metabólicas dependem exclusivamente da absorção desse aminoácido do meio fisiológico. Várias pesquisas foram feitas desde que a L-asparaginase mostrou a habilidade de reduzir alguns cânceres na década de 50. Estas pesquisas incluem a triagem de micro-organismos produtores, a otimização de meios de cultura para melhorar a produção e a procura de uma metodologia que consiga purificar a enzima a partir do estrato bruto. Tais pesquisas se intensificaram recentemente no Brasil devido a uma crise de abastecimento gerada pela interrupção da importação pelo fornecedor. A L-asparaginase é um princípio ativo de alta demanda para tratar a leucemia linfoblástica aguda e por isso deve ser produzida no Brasil. Este estudo foi realizado utilizando a linhagem Penicillium sp. T8.3 e teve como objetivo aprimorar a produção da enzima ajustando as condições de cultivo, usando glicerol e L-asparagina (como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente) e pH como as três variáveis de entrada. Os experimentos foram desenvolvidos aplicando ferramentas da estatística multivariável como planejamento fatorial, desenho composto central para gerar um modelo matemático empírico. Foram analisadas a concentração de amônio e a atividade enzimática produzida nos bioprocessos. A atividade enzimática foi determinada em reação conduzida a 37 °C e pH 7,0, condições semelhantes à do meio fisiológico. Todos os dados estatísticos foram gerados com o programa Statistica 7.0 ©. Foi produzida uma atividade máxima de 12,7 U por bioprocesso estacionário conduzido em meio ajustado com 15,5 g.L-1 de glicerol, 5,6 g.L-1 de L-asparagina e pH 4,8. Desse modo, o ajuste das condições de cultivo permitiu elevar a produção em mais de 30 vezes e alcançar uma atividade enzimática superior à maioria dos relatos da literatura que tratam da produção da enzima fúngica. O modelo estatístico previu a produção enzimática com 77% de acerto, mostrando sua validade experimental e o potencial da linhagem T8.3 para a produção de L-asparaginase eucarionte.