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Análise da composição química, atividade citotóxica e inibição de citocinas in vitro de preparações de partes aéreas da planta ageratum fastigiatum
(UFVJM, 2013) Freitas, Bethânia Alves de Avelar; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Rocha-Vieira, Etel; Universidade Fedaral dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Francischi, Janetti Nogueira; Lopes, Miriam Teresa paz; Miranda, João Luiz de; Mendonça, Vanessa Amaral
Ageratum fastigiatum é uma planta utilizada na medicina popular como anti-inflamatório e analgésico, no entanto, poucos estudos foram realizados a fim de detalhar os mecanismos envolvidos nessa atividade. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-inflamatória in vitro do óleo essencial e do extrato diclorometânico de A. fastigiatum. Pela técnica de exclusão do azul de tripam por citometria de fluxo foram determinadas concentrações não tóxicas das preparações de A. fastigiatum. As concentrações não tóxicas do óleo essencial foram 5x10-3 e 1x10-2 µL/mL. Essas concentrações foram utilizadas para a pesquisa do potencial anti-inflamatório do óleo essencial, medido por meio da análise do perfil de citocinas pro (TNF- α e IFN- γ) e anti-inflamatórias (IL-10), em culturas de leucócitos humanos estimulados e não estimulados com PMA (acetato de forbol miristato) . Os dados demonstraram que ambas as concentrações inibiram o percentual de linfócitos-TNF+ nas culturas estimuladas com PMA. A análise cromatográfica em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM) revelou como principais constituintes no óleo essencial as substâncias α-pineno (7,51%), limoneno (5,9%), óxido de cariofileno (13,59%), 1,2 epóxido humuleno (8,41%) e 1,6-humulanodien-3-ol (17,71%). O extrato diclorometânico de A. fastigiatum, na concentração 20 µg/mL, não apresentou toxicidade aos leucócitos do sangue periférico humano e reduziu o percentual de linfócitos-TNF-α+ e linfócitos-IFN-γ+ nas culturas estimuladas com o PMA. Este extrato foi fracionado em coluna de Sephadex LH-20 (150 g). Na análise de citocinas, a fração 10 (AFDM 10), na concentração 10 µg/mL, demonstrou efeito anti-inflamatório in vitro reduzindo a frequência de linfócitos-TNF-α+ e a proliferação de linfócitos estimulados com PHA (fitohemaglutinina). Sugere-se que parte da atividade anti-inflamatória de A. fastigiatum se dê pela inibição que os constituintes da planta promovem sobre a ativação de leucócitos.
Análise do comportamento proliferativo de uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae por citometria de fluxo
(UFVJM, 2017) Rodrigues, Camila Cristina; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Duarte, Rinaldo; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Duarte, Rinaldo; Santos, Alexandre Soares dos; Cardoso, Valéria Macedo
As leveduras do gênero Saccharomyces, em especial as da espécie Saccharomyces cerevisiae, são microrganismos eucarióticos unicelulares do Reino Fungi. Possuem um papel importante em processos de fermentação, como na utilização para a produção de bebidas alcoólicas e pães, sendo considerados micro-organismos seguros para alimentos. O monitoramento das matérias-primas e da proliferação de leveduras é uma necessidade para o sucesso do processo fermentativo. Nesse sentido, a citometria de fluxo, que é um método rápido e preciso, pode se apresentar como ferramenta promissora no campo da fermentação e no controle de bioprocessos. Assim, o objetivo desse trabalho foi realizar a análise do crescimento e heterogeneidade populacional de uma linhagem comercial de Saccharomyces cerevisiae pela técnica de citometria de fluxo. Para isso foi utilizada a marcação intracelular com o fluorocromo éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína. A suspensão de levedura incorporada com o fluorocromo foi transferida para tubos de ensaio contendo 10 mL de YEPD e incubada a 25º C e foram analisadas, após diferentes tempos, por citometria de fluxo, microscopia confocal e espectrofotometria. Os resultados demonstraram que foi possível observar, por citometria de fluxo, alterações morfológicas da linhagem Saccharomyces cerevisiae ao longo do tempo, bem como quantificar o decaimento da fluorescência do corante CFSE após sucessivos processos mitóticos. Por essa técnica também foi possível mensurar o número de células da linhagem estudada ao longo do processo de multiplicação comparando-se às outras metodologias comumente utilizadas para este fim. Conclui-se com esse estudo que a citometria de fluxo mostrou-se como uma ferramenta confiável e sensível para a análise do crescimento e heterogeneidade populacional de Saccharomyces cerevisiae.
Avaliação da atividade citotóxica in vitro dos extratos vegetais de Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng) R. M. King & H. Rob, Miconia ferruginata DC e Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King sobre células tumorais Jurkat
(UFVJM, 2017) Córdoba, María Angélica Mera; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Almeida, Valéria Gomes de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Martins, Helen Rodrigues; Vieira, Etel Rocha
O Cerrado mineiro possui muitas espécies vegetais utilizadas na medicina popular, dentre elas estão a Pseudobrickellia brasilensis , a Miconia ferruginata e Ageratum fastigiatum, plantas popularmente usadas como analgésico, cicatrizante e anti-inflamatório. Estudos realizados no Laboratório de Imunologia da UFVJM indicaram que extratos destas plantas possuem efeito inibitório sobre a ativação de linfócitos humanos in vitro. Em virtude disso, e com base em relatos populares sobre uma possível ação antitumoral, o objetivo principal deste trabalho foi pesquisar se estes extratos apresentariam ou não efeito citotóxico sobre a linhagem tumoral Jurkat, utilizando-se concentrações não tóxicas, já avaliadas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC). Uma vez que os extratos vegetais foram diluídos no solvente Dimetilsulfóxido (DMSO), inicialmente investigou-se a concentração máxima de DMSO que não alteraria a viabilidade das células Jurkat após 24, 48 e 72 horas de cultura. O efeito citotóxico dos extratos foi avaliado sobre linfócitos tumorais (Jurkat) e sobre linfócitos humanos de voluntários hígidos pelo método de exclusão com azul de tripan, com exceção das culturas tratadas com P.brasilensis, onde a viabilidade foi avaliada por citometria de fluxo. Também foram calculados os índices de seletividade e percentuais de eficácia dos extratos com relação ao fármaco antineoplásico Paclitaxel. Foi avaliada também a interferência desses extratos sobre as fases do ciclo celular das células Jurkat, bem como os mecanismos de morte envolvidos na ação citotóxica dos extratos. De acordo com os resultados obtidos, o DMSO não apresentou efeito tóxico sobre as células Jurkat na concentração de 1%v/v nos três tempos de incubação, sendo esta a concentração de solvente utilizada em todos os ensaios realizados. Extratos etanólicos das folhas da P. brasilensis (PBf) a 200μg/mL, das partes aéreas da A. fastigiatum (Afpa) a 50μg/mL e extratos etanólicos e aquosos da M. ferruginata (Mfet, Mfaq) a 125μg/mL mostraram maior toxicidade sobre as células Jurkat principalmente após 72h de tratamento. O tratamento, por 24h, com extrato Afpa 50 μg/mL mostrou ser o mais seletivo e eficaz com relação aos outros extratos. Foi evidenciado em todos os extratos, que nas maiores concentrações, após de 24 horas de tratamento, houve uma inibição na progressão da fase G2M do ciclo celular. O extrato das partes aéreas de Ageratum fastigiatum também produziu uma retenção dessas células na fase G0-G1. Todos os extratos induziram a apoptose as células Jurkat, onde o número de células em apoptose tardio foi predominante em relação aos processos necróticos.
Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio e da citotoxicidade in vitro mediada pelo sistema 2,4-pentanodiona/horseradish peroxidase/oxigênio
(UFVJM, 2014) Pinheiro, Náthale Rodrigues; Rodrigues, Ana Paula; Martins, Helen Rodrigues; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Rodrigues, Ana Paula; Santana, Marcos Aurélio de; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de
O sistema ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy) é uma terapia antitumoral que envolve a ativação catalítica de um pró-fármaco, nas proximidades do sítio tumoral, por uma enzima conjugada a um anticorpo monoclonal com afinidade para antígenos específicos das células tumorais. O sistema composto pela enzima Horseradish peroxidase (HRP) e ácido indol-3-acético (IAA) tem sido estudado para o emprego na terapia ADEPT, e associado à indução de apoptose de células tumorais. A 2,4-pentanodiona (PD) também atua como substrato da HRP sendo oxidada por ela através de uma reação cuja cinética é semelhante à da catálise do IAA e, portanto, pode representar uma alternativa para essa terapia. Este trabalho teve como objetivo realizar uma avaliação da citotoxicidade mediada pelos produtos provenientes da oxidação da PD pela HRP frente a diferentes linhagens celulares, utilizando para isso diferentes metodologias que determinam a viabilidade celular como o azul de Trypan, MTT e vermelho neutro assim, como a análise microscópica das alterações celulares induzidas por esses sistemas; estabelecer uma comparação com a citotoxicidade mediada pela oxidação do IAA catalisada pela mesma enzima; verificar a incidência de morte celular por apoptose mediada pelos sistemas IAA/HRP/O2 e PD/HRP/O2; além de verificar a produção e os tipos de espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas pelos dois sistemas. Os experimentos permitiram evidenciar que as combinações PD/HRP/O2 e IAA/HRP/O2 levam a formação de ERO, sendo as espécies provavelmente formadas pela oxidação da PD o radical ânion superóxido e o peróxido de hidrogênio (H2O2) e pela oxidação do IAA o H2O2. Foi observado, somente para o IAA, um aumento na formação de ERO com o uso de uma maior concentração do substrato. Quanto ao estudo de viabilidade celular, esse permitiu evidenciar, através das três metodologias, o efeito citotóxico dos sistemas PD/HRP/O2 e IAA/HRP/O2, no entanto, o ensaio do MTT mostrou-se mais sensível para esse estudo. A oxidação do IAA pela HRP induziu apoptose, contudo não foi possível identificar o tipo de morte celular mediada pelo sistema PD/HRP/O2, provavelmente devido a um problema técnico durante algumas análises em citometria de fluxo, o Quenhcing. Apesar de o sistema IAA/HRP/O2 ter apresentado uma destruição celular mais expressiva, o substrato IAA quando testado na ausência da enzima mostrou-se tóxico, o que não foi visto para a PD quando testada nas concentrações de 1; 1,5 e 2 mM, o que a torna um bom substrato para o emprego na terapia ADEPT.
Avaliação dos efeitos anti-inflamatório e antiedematogênico do gel Oxyflower® em modelo de edema de pata em ratos
(UFVJM, 2017) Cruz, Timilly Mayra Martins da; Araújo, Cintia Tereza Pimenta de; Pereira, Wagner de Fátima; Gonçalves, Patrícia Furtado; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Araújo, Cintia Tereza Pimenta de; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Mesquita, Ana Terezinha Marques
Introdução: A inflamação é um mecanismo de defesa primária que protege o organismo de estímulos nocivos ou prejudiciais. Os medicamentos anti-inflamatórios tais como os Anti-Inflamatórios Não Esteroidais (AINEs) e os corticosteróides são utilizados para tratar os distúrbios inflamatórios, porém, diversos efeitos colaterais têm sido relatados. Neste contexto, produtos naturais têm contribuído bastante para o desenvolvimento de terapias farmacológicas modernas e eficazes. Alguns medicamentos naturais apresentam grande potencial terapêutico, como por exemplo, o Oxyflower®. Este remédio baseia-se na ação de essências florais, porém seus efeitos biológicos ainda não foram devidamente investigados. Objetivos: Investigar os possíveis efeitos anti-inflamatório e antiedematogênico do gel Oxyflower® em modelo animal de inflamação crônica. Metodologia: 25 ratos machos da linhagem Holtzman foram aleatoriamente divididos em 5 grupos experimentais (controle, veículo do Oxyflower®, Oxyflower®, triancinolona acetonida e diclofenaco dietilamônio). A inflamação foi quimicamente induzida por meio da injeção de 200 μL de Adjuvante Completo de Freund (ACF) na pata traseira direita dos ratos. O volume e espessura das patas dos ratos foram mensurados com pletismômetro de pata e paquímetro digital, respectivamente. Durante 14 dias, os animais foram tratados com os fármacos e tiveram acompanhamento de sua massa corporal. Neste período a temperatura das patas traseiras foram avaliadas com um termógrafo digital. Foram realizadas análises histológicas e leucometria. Os dados foram analisados como média  erro padrão ou desvio padrão da média e apresentados como a variação (delta) do volume, espessura e temperatura das patas traseiras. As diferenças entre os grupos foram analisadas pelos testes de variância ANOVA (two e one-way), seguidos do post hoc de Tukey e teste Qui-Quadrado. Valores de p< 0,05 foram considerados significativos. Resultados: O gel Oxyflower® promoveu reduções no volume, espessura e temperatura das patas dos ratos, injetados com ACF, quando comparados aos animais do grupo controle. Não houve diferença em relação ao ganho de massa corporal nos diferentes grupos experimentais. Os resultados para leucometria e histologia não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. Conclusão: O gel Oxyflower® apresentou atividade antiedematogênica semelhante à Triancinolona e ao Diclofenaco. A termografia infravermelha é um método aplicável na avaliação da temperatura tecidual associada ao edema, neste modelo experimental.
Avaliação in vitro das atividades antioxidante e anti-inflamatória de extratos de diferentes partes da espécie Miconia ferruginata DC.
(UFVJM, 2021) Lima, Artenizia Criste; Martins, Helen Rodrigues; Almeida, Valéria Gomes de; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Martins, Helen Rodrigues; Oliveira, Eduardo de Jesus; Esteves, Elizabethe Adriana
A importância das plantas medicinais e seus efeitos terapêuticos vêm sendo constatada ao longo do tempo, e muitas vezes, estas são usadas como único recurso para o tratamento de diversas doenças. A espécie Miconia ferruginata DC. (Melastomataceae) é conhecida popularmente como pixirica-do-campo ou babatenão, tem sido usada na medicina popular para tratar inflamações e infecções. Considerando o seu uso popular e os resultados promissores para o potencial anti-inflamatório, antitumoral e antioxidante, maiores esforços na investigação terapêutica da M. ferruginata tornam-se necessários, a fim de validar tal potencial. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar as atividades antioxidante e anti-inflamatória de extratos etanólicos brutos de folhas, do caule, de inflorescência e da casca da espécie Miconia ferruginata DC. A quantificação de compostos fenólicos e a avaliação da atividade antioxidante in vitro dos extratos foi realizada por meio da espectrofotometria. Todos os extratos brutos de Miconia ferruginata apresentaram teores de compostos fenólicos totais (CFT) com destaque para o extrato de inflorescência (120,137 mg EAG/g extrato). A atividade redutora dos extratos avaliada pela captura do radical DPPH● demonstrou maior captura para o extrato de caule (EC50 de 483,58 μg/mL μg/mL). A citotoxicidade dos extratos foi avaliada sobre células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humano, após 24 horas ou cinco dias de cultura, empregando o método de exclusão com azul de Tripan. Concentrações não tóxicas dos extratos M. ferruginata foram utilizadas para avaliar o efeito dos extratos sobre a proliferação de linfócitos e suas subpopulações TCD4 e TCD8, observando-se o decaimento da fluorescência de células marcadas com VPD450, em culturas estimuladas pela fitohemaglutinina (PHA). Os extratos apresentaram efeito inibitório sobre a resposta proliferativa de linfócitos e de suas subpopulações T CD4 e T CD8. A produção das citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α e IL-2) por PBMC tratadas com os extratos e estimuladas com PMA e ionomicina também foi avaliada, utilizando a técnica de citometria de fluxo. Os extratos não tiveram efeito sobre a produção das citocinas IFN-γ e TNF-α pelos linfócitos totais. No entanto, houve diminuição de IL-2 em linfócitos totais tratados com extrato bruto de inflorescência. Assim, no presente estudo os extratos etanólicos brutos de Miconia ferruginata mostraram atividade antiproliferativa, a inibição da proliferação de linfócitos pelo extrato de inflorescência parece estar associada à inibição da citocina mitogênica IL-2. É provável que a atividade antioxidante observada possa estar relacionada a presença de compostos fenólicos nos extratos brutos de folhas, de caule, de inflorescência e da casca, sendo necessário maiores investigações para comprovação da provável associação destas atividades.
Composição química e efeito sobre mediadores inflamatórios de preparações de partes aéreas de Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng) R. M. King & H. Rob (arnica-do-campo) in vitro
(UFVJM, 2015) Almeida, Valéria Gomes de; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Universidade Fedaral dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Rocha-Vieira, Etel; Lopes, Miriam Teresa Paz; Santos, Raquel Gouveia dos; Pereira, Wagner de Fátima
A Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng) R. M. King & H. Rob., (Asteraceae) é nativa da flora brasileira, e sua preparação alcoólica tem sido utilizada de forma tópica como anti-inflamatório na medicina popular. Tendo em vista a ausência de estudos acerca da bioatividade e composição química dessa espécie, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito de preparações de partes aéreas de P.brasiliensis sobre parâmetros inflamatórios, in vitro, e realizar a análise dos seus constituintes químicos. A triagem fitoquímica dos caules, flores e folhas da planta foi realizada por meio de reações cromogênicas, fluorogênicas e de precipitação e sugeriu a presença de saponinas, terpenos, taninos e flavonoides nas partes aéreas da planta. Os extratos etanólicos de caules (PBETca), flores (PBETfl) e folhas (PBETfo) foram avaliados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD). Essa análise sugeriu a presença de flavonoides nos extratos, especialmente das classes das flavonas e flavonóis. Os óleos essenciais de flores (PBOEfl) e de folhas (PBOEfo) foram analisados por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrômetro de Massas (CG-EM), sendo possível a identificação de 22 compostos no PBOEfl e 27 no PBOEfo, dentre os quais, o β-pineno, limoneno, α-pineno, sabineno, óxido de cariofileno e E-cariofileno estão presentes em maior valor percentual. Foram confeccionadas culturas de 4h de sangue total para avaliar o efeito hemolítico dos extratos, determinado pela densidade óptica do sobrenadante em 540 nm. Houve indução de hemólise em culturas tratadas com PBETca ou PBETfo em concentrações superiores a 100 μg/mL. O extrato PBETfl induziu hemólise em culturas na concentração final de 200 μg/mL. A toxicidade dos produtos naturais às Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) humano após 24 h e 5 dias, foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando Azul de Tripan ou Iodeto de Propídeo. O efeito dos produtos naturais sobre a produção de TNF-α, IFN-γ e IL-2 foi determinado por ELISA do sobrenadante de culturas de 24 h, após estímulo com Miristato Acetato de Forbol (PMA) + Ionomicina. Todos os extratos e óleos essenciais reduziram a produção de TNF-α. A síntese de IFN-γ foi inibida pelo extrato PBETfo e pelo óleo essencial PBOEfl. Todos os extratos etanólicos e o PBOEfl, inibiram a produção de IL-2. O PBETfo foi fracionado por meio de partição em solventes com polaridade crescente e todas as frações foram eficientes em inibir a síntese de TNF-α, por PBMC, após 24 h de cultura. Somente a fração hexânica reduziu a síntese de IFN-γ e IL-2. Foram confeccionadas culturas de sangue total estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) para investigação do efeito dos óleos essenciais sobre a expressão de COX-2, por citometria de fluxo. Os óleos essenciais não interferiram na expressão de COX-2. Nossos achados sugerem que o efeito anti-inflamatório atribuído à P.brasiliensis na medicina popular pode, pelo menos em parte, ser devido à inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias por linfócitos e monócitos humanos. É possível que flavonoides das subclasses das flavonas e flavonóis possam contribuir para a atividade biológica dos extratos etanólicos de P. brasiliensis. Muitos monoterpenos e sesquiterpenos presentes nos óleos essenciais de flores e folhas de P. brasiliensis já tiveram a atividade anti-inflamatória descrita em outros trabalhos.
Detecção in vitro de citocinas intracitoplasmáticas (interferon gama, fator de necrose tumoral, interleucina 4 e interleucina 10) em leucócitos humanos tratados com extrato bruto diluído de euphorbia tirucalli
(UFVJM, 2010) Avelar, Bethânia Alves de; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Lopes, Miriam Tereza da Paz; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Francischi, Janetti Nogueira de; Fagundes, Elaine Maria de Souza
O uso de plantas da família Euphorbiaceae, principalmente do gênero Euphorbia, tem sido popularmente difundido para o tratamento de uma variedade de doenças de natureza infecciosa, tumoral e inflamatória. Entre as espécies desse gênero, a Euphorbia tirucalli é uma planta de uso difundido no Brasil e em algumas regiões, tal como a do Vale do Jequitinhonha. Há indícios de que o látex de E. tirucalli tenha atividade antitumoral e antiviral, porém, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nessa ação. É provável que o mecanismo de ação para tais atividades envolva a ativação de leucócitos e a produção de citocinas para o direcionamento de uma resposta antiviral e antitumoral efetivas. Diante disso, o presente trabalho avaliou a produção de citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas populações e subpopulações leucócitárias do sangue periférico estimulados com o látex bruto da referida planta. Para tal, leucócitos do sangue periférico de vinte indivíduos hígidos foram incubados por 4 horas com o látex bruto de E. tirucalli diluído em Dimetilsulfoxido (DMSO) e constituiu o grupo látex (Lt). Culturas celulares incubadas com salina e DMSO, utilizando-se o mesmo período de incubação, constituíram as culturas controle não estimuladas (CC) e controle de solvente (DMSO), respectivamente. Após o período de incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos para receptores de superfície celular CD4, CD8 e CD14, bem como para as citocinas intracitoplasmáticas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10. A aquisição e análise dos dados foram realizadas por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram um aumento significativo (p < 0,05) no percentual de linfócitos T e sua subpopulação T CD4 positivos para as citocinas do tipo 1, TNF-α e IFN-γ. Essas citocinas são responsáveis por ativar o sistema imune para respostas imunoprotetoras frente às infecções virais e processos tumorais. Já os neutrófilos e linfócitos T CD8, nas culturas estimuladas com o látex da planta, apresentaram um perfil misto de produção de citocinas do tipo 1 e 2. Esses resultados evidenciaram uma resposta do tipo 1 predominante, in vitro, e uma provável ativação de mecanismos moduladores, mediados por linfócitos T CD8 e neutrófilos. Este estudo sugere que a utilização popular da planta em infecções virais e processos tumorais pode ter algum fundamento, tendo em vista a produção preferencial de citocinas do tipo 1 em células estratégicas da resposta imune celular, fundamental no combate às patologias mencionadas. No entanto, os estudos in vitro aqui realizados não são suficientes para garantir que a utilização da planta no contexto in vivo possa, de fato, apresentar tais propriedades. Assim, estudos adicionais, incluindo outros ensaios in vitro, bem como ensaios pré-clínicos, são fundamentais para o avanço das pesquisas envolvendo a utilização de E. tirucalli para fins terapêuticos.
Efeito do extrato etanólico de Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King et H. Rob. e de sua fração sobre a produção de citocinas e proliferação de linfócitos humanos, in vitro
(UFVJM, 2016) Costa, Lucas de Abreu; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Esteves, Elizabethe Adriana; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Esteves, Elizabethe Adriana; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Sivieri Júnior, Disney Oliver; Vieira, Etel Rocha
A planta Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King et H. Rob. é comumente utilizada na medicina popular da região do Vale do Jequitinhonha como anti-inflamatório e analgésico. Em virtude do papel do sistema imune e de fatores inflamatórios solúveis na etiologia e no mecanismo fisiopatológico de diversas doenças inflamatórias, este trabalho teve como objetivo investigar parâmetros relacionados à atividade anti-inflamatória do extrato etanólico de A. fastigiatum e de uma fração derivada desse extrato. A identificação dos constituintes químicos da fração do extrato etanólico de A. fastigiatum foi realizada por meio da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detectores de Arranjo de Diodo acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-MS) seguida pela Espectrometria de Massas em Tandem com ionização por electrospray (ESI-MS/MS). A técnica de exclusão com azul de tripan foi utilizada para determinação da viabilidade das culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) incubadas por 8, 24 e 120 horas com o extrato etanólico, a fração e o solvente Dimetilsulfóxido (DMSO). Na avaliação do perfil proliferativo de linfócitos pela técnica de citometria de fluxo, PBMC estimuladas com o mitógeno Fitohemaglutinina (PHA) foram incubados por 120 horas na ausência ou presença de diferentes concentrações não tóxicas dos componentes citados. Para análise da produção das citocinas pró-inflamatórias, PBMC tratadas ou não com diferentes concentrações não tóxicas do extrato etanólico de A. fastigiatum, da fração e do solvente DMSO foram incubadas por 8 horas e estimulada nas últimas 4 horas com Miristato Acetato de Forbol (PMA), utilizando a técnica de citometria de fluxo, linfócitos totais, células CD4+ e CD8+ foram avaliados quanto à produção de IFN-γ, TNF-α e IL-2. De acordo com nossos resultados, a concentração de DMSO, para todas as culturas celulares tratadas com o extrato etanólico ou sua fração, foi definida como sendo 1% v/v para avaliação da citotoxicidade e análise da produção de citocinas em linfócitos e de 0.5% v/v no ensaio de proliferação celular. Na análise fitoquímica da fração do extrato etanólico foram identificados dois flavonóis nunca antes descrito na constituição química da planta, a 7-metil-quercetina e a Rhamnocitrina, tais compostos não alteraram os parâmetros anti-inflamatórios avaliados neste estudo. O extrato etanólico, por sua vez, nas concentrações de 6,25 e 12,5 μg/mL reduziu significativamente a proliferação de linfócitos, ao mesmo tempo, nas concentrações de 50 e 75 μg/mL inibiu a produção das citocinas TNF-α e IL-2 em células CD8+, na maior concentração inibiu ainda a produção de IL-2 na população de linfócitos totais. Sugere-se que o extrato etanólico de A. fastigiatum possui componentes ativos agindo sinergicamente ou de forma isolada que contribuem para atividade anti-inflamatória atribuída à planta em seu uso na medicina popular.
Efeito dos extratos etanólicos de partes aéreas e de raízes de Eriosema campestre var. macrophyllum (Grear) Fortunato sobre ativação e proliferação de linfócitos, in vitro
(UFVJM, 2018) Santos, Michaelle Geralda dos; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Oliveira, Danilo Bretas de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Oliveira, Danilo Bretas de; Esteves, Elizabethe Adriana; Thomasini, Ronaldo Luis; Klein, André; Campana, Priscilla Rodrigues Valadares
A Eriosema campestre var. macrophyllum (Grear) Fortunato é uma planta nativa do Cerrado brasileiro e tem sido utilizada no Vale do Jequitinhonha pelas vias oral e tópica como antiinflamatória. Tendo em vista a escassez de estudos acerca da atividade biológica, o objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito dos extratos etanólicos de partes aéreas e de raízes de Eriosema campestre (ETEC-AE e ETEC-RA, respectivamente) sobre a ativação e proliferação de linfócitos, in vitro. Primeiramente, foi avaliada a citotoxicidade dos extratos sobre células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humano, após 24 horas ou 5 dias de cultura, pelo método de exclusão com azul de Tripan. Concentrações não tóxicas de ETEC-AE e ETEC-RA foram utilizadas para avaliar o efeito dos extratos sobre a proliferação de linfócitos e suas subpopulações TCD4 e TCD8, pelo decaimento da fluorescência de células marcadas com VPD450, em culturas de 5 dias estimuladas pela fitohemaglutinina (PHA). Foi avaliado também o efeito dos extratos sobre a expressão de CD25, a cadeia α do receptor de IL-2 (IL-2R), bem como a produção e expressão gênica de IL-2. Os extratos inibiram a proliferação de linfócitos totais e de suas subpopulações, reduziram a produção e expressão gênica de IL-2, mas não tiveram efeito sobre a expressão de CD25. Em seguida, foi avaliada a resposta proliferativa de linfócitos adicionando-se os extratos em diferentes tempos após a ativação das culturas celulares. O efeito antiproliferativo foi mais pronunciado com a adição dos extratos até 24 horas após o estímulo, sugerindo que a inibição da resposta proliferativa por ETEC-AE e ETEC-RA ocorre devido à ação dos mesmos sobre elementos bioquímicos atuantes em etapas iniciais e tardias da fase G1 do processo de divisão dos linfócitos T. Na sequência, a análise do ciclo celular de linfócitos estimulados com PHA e tratados com os extratos vegetais revelou uma retenção dessas células na fase G1 do ciclo, o que contribui para a redução da proliferação observada anteriormente. Tendo em vista a participação de ciclinas na regulação do processo de divisão celular, foi investigado o efeito de ETEC-AE e ETEC-RA sobre a expressão gênica das ciclinas D2, D3, E, A1 e B1. Os extratos inibiram a expressão gênica da ciclina D2. Além da atividade dos extratos sobre parâmetros relacionados à proliferação celular, foi avaliado se os mesmos teriam efeito sobre a resposta efetora dos linfócitos e suas subpopulações TCD4 e TCD8, por meio da investigação da produção das citocinas IFN-γ e TNF-α em culturas estimuladas com PMA e ionomicina e tratadas com ETEC-AE ou ETEC-RA. Os extratos não tiveram efeito sobre a produção dessas citocinas. Para determinar as principais classes de metabólitos secundários presentes na planta que poderiam ser responsáveis pelos efeitos encontrados e direcionar análises químicas posteriores, foi realizada a triagem fitoquímica por meio de reações cromogênicas e de precipitação, sendo possível sugerir a presença de flavonoides, saponinas e triterpenos em partes aéreas e raízes, além de taninos em partes aéreas. Os dados obtidos indicam que ETEC-AE e ETEC-RA apresentam efeito inibitório sobre a resposta proliferativa de linfócitos e de suas subpopulações T CD4 e T CD8, sendo que este efeito parece estar associado à inibição da entrada de linfócitos T na fase S do ciclo celular devido à redução na expressão gênica da ciclina D2 e, provavelmente em vias de sinalização na fase G1 tardia. Além disso, os resultados sugerem que os extratos atuam reduzindo a produção e expressão gênica da citocina IL-2. Pode-se sugerir que substâncias da classe dos flavonoides podem ser responsáveis pelos efeitos biológicos observados conforme apontado para outras espécies do gênero Eriosema. Dessa forma, o trabalho pode explicar, pelo menos em parte, os atributos terapêuticos da planta na medicina popular.
Efeito modulador do exercício aeróbico sobre TNT-α e seus receptores solúveis, IL-6,BDNF, células T e na funcionalidade de idosas da comunidade com osteartrite de joelho
(UFVJM, 2014) Gomes, Wellington Fabiano; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Mendonça, Vanessa Amaral; Universidade Fedaral dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Lacerda, Ana Cristina Rodrigues
A osteartrite de joelho (OAj) é uma doença que afeta principalmente os idosos e pode levar a grandes limitações físicas e funcionais. No entanto, os efeitos específicos da terapia por exercícios, especialmente a caminhada sobre o sistema imunológico, são desconhecidas. Portanto, este estudo teve como objetivo analisar o efeito de 12 semanas de caminhada (3x / semana) no perfil de leucócitos, nos níveis plasmáticos de interleucina (IL-6), do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), dos receptores solúveis de TNF-α (sTNFR1 e sTNFR2), e do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) a partir de plasma retirado do sangue periférico de mulheres idosas com OAj. Além disso, as avaliações clínicas e funcionais (teste de WOMAC, teste de caminhada de 6 minutos, SF-36, a percepção da dor) foram realizadas. Dezesseis mulheres (idade: 67 ± 4 anos, índice de massa corporal: 28,07 ± 4,16 kg/m2) participaram de um programa de caminhada (36 sessões de fisioterapia) e de um esforço físico (01 sessão de fisioterapia). As variáveis foram avaliadas antes e após 12 semanas de treinamento com duração (30-55 min) e intensidade (70-80% da FCmáx) progressivamente maiores. As amostras de sangue coletadas foram analisadas com um contador de células, citômetro de fluxo e pelo método ELISA. As sessões de fisioterapia resultaram em um aumento de 47% da qualidade de vida (p <0,05) e um aumento de 21% no VO2max (p <0,0001) em mulheres idosas com OAj. Além disso, houve uma redução nas células T CD4 + (antes 46,59 ± 7%, depois 44,58 ± 9%, p = 0,0189) e uma intensidade de fluorescência mais elevada para CD18 + CD4 + (antes 45,30 ± 10, depois de 64,27 ± 33, p = 0,0256) e CD18 + CD8 + (antes: 64,2 ± 27, depois de 85,02 ± 35, p = 0,0130). A ET aumentou a concentração plasmática de sTNR1; no entanto, diminuiu a concentração de plasma de sTNFR2, quando comparado com os níveis em repouso de pacientes. O exercício agudo afetou diferencialmente os níveis de sTNFR1 dependente de quando as amostras foram tomadas, antes e após o treinamento aeróbico. No entanto, os níveis de sTNFR2 não foram afetados pelo treinamento. O exercício agudo aumentou os níveis de BDNF apenas antes do período de treinamento de 12 semanas (p <0,001). Além disso, houve aumento das concentrações plasmáticas de BDNF (p <0,0001) e melhora em parâmetros clínicos (funcional p <0,001; percepção da dor p <0,01). A variação dos níveis de receptores solúveis correlacionou-se com a melhora funcional; no entanto, os marcadores inflamatórios de osteoartrite (IL-6 e TNF-α) não foram afetados pelas 36 sessões de fisioterapia.
Efeitos da adição da vibração de todo o corpo ao exercício em cadeia cinética fechada (agachamento) sobre parâmetros inflamatórios e neuroendócrinos e a sua associação com o desempenho e a capacidade funcional em idosos com osteoartrite de joelho
(UFVJM, 2013) Simão, Adriano Prado; Lacerda, Ana Cristina Rodrigues; Coimbra, Cândido Celso; Universidade Fedaral dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Francischi, Janetti Nogueira; Pereira, Leani Souza Máximo; Thomasini, Ronaldo Luis; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de
Introdução: Recentemente, a vibração de todo o corpo (VTC) tem sido um método de exercício físico indicado para aumentar o desempenho e a capacidade físico-funcional de idosos com osteoartrite (OA) de joelho. No entanto, os mecanismos relacionados aos efeitos produzidos por essa modalidade ainda não foram completamente investigados. Objetivos: O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da adição de VTC aos exercícios de agachamento na concentração plasmática de marcadores inflamatórios e no desempenho e capacidade funcionais de idosos com OA de joelho na fase remissiva da doença (Estudo 1) e investigar os efeitos da adição do treinamento de VTC ao exercício de agachamento em mulheres idosas com OA de joelho na fase remissiva da doença nos seguintes parâmetros: 1) força isométrica do músculo quadríceps; 2) concentração plasmática de BDNF; e 3) na concentração salivar da razão testosterona/cortisol (Estudo 2). Investigar a relação entre os níveis plasmáticos e no líquido sinovial do TNF- e seus receptores solúveis (sTNFR1 e sTNFR2) assim como de BDNF em idosos com OA de joelho e ainda verificar a relação destes com a gravidade da OA e o autorrelato de dor, rigidez e função física com o WOMAC (Western Ontario and McMaster University Osteoarthritis Index) em idosos com OA de joelho na fase inflamatória aguda (Estudo 3). Metodologia: No estudo 1, trinta e dois idosos com OA de joelho foram divididos em três grupos: grupo que realizou exercício de agachamento associado a plataforma vibratória (grupo plataforma N=11), grupo que realizou exercício de agachamento sem vibração (grupo agachamento N=10) e o grupo controle (N=11). Um programa estruturado de exercícios de agachamento foi executado três vezes por semana em dias alternados por doze semanas nos grupos plataforma e agachamento. A concentração plasmática de receptores solúveis de TNF- (sTNFR1 e sTNFR2) foi analisada usando a técnica de ELISA. O WOMAC foi usado para avaliar o autorrelato da função física, dor e rigidez. O teste de caminhada de 6 minutos, a escala de Berg e o teste de velocidade da marcha foram utilizados para avaliar a função física. No estudo 2, foram selecionadas quinze mulheres idosas com idade maior ou igual a 60 anos que tinham sido diagnosticadas com OA em pelo menos um joelho. A intervenção consistiu de doze semanas seguidas de exercícios de agachamento, 3 vezes por semana. O protocolo de exercício foi similar em ambos os grupos diferindo apenas da presença de vibração. Já no estudo 3 participaram vinte e sete idosos diagnosticados com osteoartrite de joelho e dezenove idosos saudáveis. Radiografias ântero-posteriores do joelho foram realizadas para determinar a gravidade da doença no joelho afetado. A classificação radiográfica da OA do joelho foi realizada utilizando os critérios Kellgren-Lawrence. Os níveis de TNF-α, sTNFR1, sTNFR2 e BDNF no plasma e no líquido sinovial foram determinados por ELISA. Resultados: No estudo 1, o grupo que realizou exercícios de agachamento na plataforma vibratória mostrou diminuição nas concentrações plasmáticas dos marcadores inflamatórios sTNFR1 e sTNFR2 (p<0,001 e p<0,05, respectivamente), no autorrelato da dor (p<0,05), melhora no equilíbrio (p<0,05) e na velocidade e distância caminhada (p<0,05 e p<0,001, respectivamente) comparado com o grupo controle. O teste de velocidade da marcha também apresentou aumento no grupo plataforma quando comparado ao grupo agachamento (p<0,01). Os resultados do estudo 2 demonstraram uma variação (∆) positiva dos valores da força isométrica muscular do quadríceps (p=0,02) e da concentração plasmática de BDNF (p=0,03) no grupo vibração após o período de intervenção. A variação (∆) na razão testosterona/cortisol (T/C) não diferiu significativamente, entre os grupos (p=0,61). No estudo 3, os níveis de BDNF no líquido sinovial correlacionou-se significativamente com dor autorrelatada [WOMAC] (rs = 0,39, p=0,04). Com relação aos receptores solúveis para TNF-α, observou-se uma diferença entre os níveis de sTNFR1 e de sTNFR2, tanto no plasma quanto no líquido sinovial em pacientes com OA do joelho (1091 ± 99,48 pg / mL versus 2249 ± 126,3 pg / mL e 2587 ± 66,12 pg / mL versus 2021 ± 107,0 pg / mL, respectivamente). Além disso, os níveis de sTNFR1 no líquido sinovial foram, negativamente, correlacionadas com a dor e a função física autorrelatada (rs -0,6785, p<0,0001 e rs -0,4194; p=0,03, respectivamente). Ao passo que, os níveis de sTNFR2 no líquido sinovial foram negativamente correlacionadas com dor e rigidez articular (rs -0,5433, p=0,01 e rs -0,4249; p=0,02, respectivamente). Conclusões: Os resultados dos estudos supracitados indicam que a adição da vibração de todo o corpo ao treinamento com exercício de agachamento, nas condições experimentais propostas, melhora o equilíbrio estático e dinâmico e o desempenho da marcha e ao mesmo tempo reduz a autopercepção de dor e a concentração de marcadores inflamatórios (sTNFR1 e sTNFR2) em idosos com OA de joelho na fase de remissão da doença. Além disso, a associação da vibração de todo o corpo ao exercício de agachamento promove uma melhora na força muscular de membros inferiores em mulheres idosas com OA de joelho na fase de remissão da doença e proporciona uma resposta adaptativa na concentração de BDNF sem alteração na relação muscular de anabolismo/catabolismo. Já os resultados da relação entre sistêmico e local, indicam que os níveis de BDNF sistêmicos estão associados com o mecanismo da dor articular na OA de joelho. Com relação aos receptores solúveis de TNF-α, evidenciou-se a presença de receptores solúveis para TNF- no líquido sinovial de pacientes com OA primária de joelho e a relação destes receptores com parâmetros clínicos.
Efeitos da ingestão do óleo de pequi (Caryocar brasiliense) na resposta imune da mucosa intestinal de camundongos
(UFVJM, 2019) Moreno, Lauane Gomes; Esteves, Elizabethe Adriana; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Esteves, Elizabethe Adriana; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Sampaio, Kinulpe Honorato; Silva, André Talvani Pedrosa da; Maioli, Tatiane Uceli; Pereira, Wagner de Fátima
Atualmente, diversas áreas científicas têm focado suas pesquisas em propriedades funcionais de alimentos e produtos alimentícios, das quais destacam-se efeitos imunomoduladores. Dentre esses alimentos está o óleo de pequi (Caryocar brasiliense), que apresenta diversos efeitos biológicos tais como melhoria do metabolismo lipídico, melhoria da função cardiovascular e atividade antioxidante. Esse óleo contém em sua composição química um alto conteúdo de carotenoides e ácidos graxos monoinsaturados, que de acordo com estudos prévios, isoladamente, podem alterar a resposta imune, em especial a resposta imune da mucosa intestinal. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi investigar os efeitos da ingestão do óleo de pequi (Caryocar brasiliense) na resposta imune de mucosa intestinal de camundongos. Para isso foram investigados os efeitos da ingestão diária de 280mg de óleo de pequi em elementos da resposta imune da mucosa intestinal em duas condições: 1) na mucosa íntegra e 2) na ruptura da integridade da mucosa, representada por uma doença inflamatória intestinal. Foram utilizados 60 camundongos C57BL/6 machos, que após o período de adaptação (7 dias), iniciaram a Fase 1 do estudo (suplementação com óleo de pequi, 28 dias). Tais animais foram divididos em: Grupo Controle (C) que recebeu apenas ração comercial e água filtrada ad libitum e grupo Óleo de Pequi (OP) que recebeu diariamente, além da ração e água, 280 mg de óleo de pequi homogeneizados em 1,11g de ração triturada, na forma de um pellet. Após esse período, cada um dos dois grupos experimentais foi sub-dividido em grupos C, Controle com Colite (CC), OP e Óleo de Pequi com Colite (OPC). Deu-se início então à Fase 2 do estudo referente à continuidade da suplementação e indução da doença inflamatória intestinal por 8 dias. Na Fase 2, os grupos CC e OPC passaram a receber, além dos tratamentos iniciais, solução aquosa de dextran sulfato de sódio (DSS), a 1,5%, ad libitum. A ingestão alimentar e o peso corporal foram monitorados durante todo o experimento. No nono dia, após a fase 2, os animais foram eutanasiados para coleta de amostras. Foi avaliado o fenótipo de leucócitos isolados das superfícies das mucosas do intestino delgado (ID) e cólon, dos linfonodos mesentéricos e do baço. Determinou-se também as concentrações de Imunoglobulina A (IgA) no plasma e de IgA secretória (IgAs) nos lavados de ID, cólon, e fezes, das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, TNFα, IFNγ, IL-17, IL-10 no plasma e em homogenatos de ID e cólon e de proteína C reativa (C reactive protein - CRP) no plasma. Durante a indução da colite foi calculado o Índice de Atividade de Doença (scores médios de diarreia, sangramento retal e perda de peso) e ao final foi avaliado o score histopatológico total na mucosa colônica. Na integridade da mucosa, a ingestão do óleo de pequi (OP vs C, p<0,05) induziu no ID redução de linfócitos de superfície T totais, T auxiliares e de IFNγ; no cólon, redução de linfócitos de superfície T citotóxicos e IgAs; nos linfonodos, redução de linfócitos T citotóxicos; no baço, redução de linfócitos T auxiliares e citotóxicos; e no plasma redução de IL-2, CRP e do % de neutrófilos e aumento de IL-10 e do % de linfócitos. Em condições de ruptura da integridade da mucosa intestinal, a ingestão do óleo de pequi (OPC vs CC, P<0,05), reduziu a perda de peso e diarreia. No ID elevou linfócitos de superfície T γδ e reduziu IL-6, no cólon também elevou os linfócitos de superfície T γδ e reduziu os T citotóxicos e a perda de criptas e células caliciformes; nos órgãos linfoides essa ingestão reduziu linfócitos T citóxicos e no plasma reduziu a IL-17 e a CRP. Assim, a ingestão do óleo de pequi parece ter reforçado a resposta reguladora do sistema imune de mucosa, o que possivelmente contribuiu para que, em condições de ruptura da integridade intestinal, houvesse melhoria do quadro clínico e histopatológico, elevação de células com potencial de ação regulatória e redução de mediadores pró-inflamatórios e de células com atividade citotóxica.
Estudos para triagem eletroquímica do canabinoide sintético 5F-MDMB-PICA em amostras forenses usando eletrodo de diamante dopado com boro
(UFVJM, 2022) Araújo, Daniel de Souza; Santos, Wallans Torres Pio dos; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Santos, Wallans Torres Pio dos; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Silva, Rodrigo Amorim Bezerra da
O uso de canabinoides sintéticos (CS), como uma possível alternativa à Cannabis, tem crescido bastante nos últimos anos ao redor do mundo. Todavia, os CS são também considerados drogas ilegais em vários países, como no Brasil. Um dos CS que vem sendo mais reportado é conhecido como 5F-MDMB-PICA. No sentido de combater tráfico e uso destes entorpecentes é de extrema importância o desenvolvimento de métodos analíticos mais eficientes para realizar uma identificação preliminar (triagem) simples e rápida de CS em amostras forenses. Neste contexto, este trabalho apresenta, pela primeira vez, um método eletroquímico para determinação de 5F-MDMB-PICA em amostras apreendidas. O método proposto é baseado na detecção voltamétrica do 5F-MDMB-PICA usando o eletrodo de diamante dopado com boro (BDDE). Nestas condições, este CS apresentou apenas um processo de oxidação irreversível em torno 1,19 V (vs Ag/AgCl) em meio de H2SO4 0,1 mol L−¹. Como a mólecula do 5F-MDMB-PICA apresentou adsorção no BDDE, a técnica de voltametria de pulso diferencial com redissolução adsortiva (AdSDPV) foi otimizada para detecção deste analito com tempo de acumulação de 2 min. Uma ampla faixa linear de trabalho foi obtida (1,0 a 100 μmol L-¹) pelo método proposto para determinação de 5F-MDMB-PICA com um baixo limite de detecção de 0,08 μmol L−¹. A seletividade do BDDE com AdSDPV foi avaliada usando outros seis CS encontrados em amostras forenses, tendo em vista que testes falso-positivos são possíveis na presença de outras drogas ilícitas. Por outro lado, testes falsos-negativos para indentificar o 5F-MDMB-PICA em amostras forenses mostram ser improváveis usando o método proposto. Além disso, o BDDE mostrou uma boa estabilidade do sinal analítico para detecção deste CS. A identifição do 5F-MDMB-PICA em amostras reais apreendidas foi realizada e confirmada por métodos definitivos (HPLC-MS). Estudos de adição-recuperação também nestas amostras apresentaram valores próximos de 100%. Portanto, o método proposto demonstra um grande potencial para aplicação na detecção e triagem do 5F-MDMB-PICA em análises forenses.
Indução de fluorescência interferente em culturas de linfócitos humanos pelo tratamento com três extratos vegetais
(UFVJM, 2017) Ottoni, Marcelo Henrique Fernandes; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Pereira, Wagner de Fátima; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Sampaio, Kinulpe Honorato; Carvalho Júnior, Álvaro Dutra de
A presença de fluorescência interferente em uma dada amostra é considerada como um importante problema em métodos fluorimétricos, devido à possível sobreposição espectral entre ela e a emissão fluorescente de sondas. Por isso, é importante conhecer se há fluorescência interferente em uma dada amostra e substâncias de interesse nas condições de trabalho pretendidas. No presente estudo, foi avaliada a presença de fluorescência interferente em linfócitos humanos após o tratamento com extratos de três diferentes plantas medicinais, sendo estas, objeto de estudo do nosso grupo de pesquisas. Os extratos são: o extrato etanólico das partes aéreas de Ageratum fastigiatum, extrato etanólico das partes aéreas de Eriosema campestre e o extrato etanólico do caule de Pseudobrickellia brasiliensis. Foi coletado o sangue de três voluntários para a separação das células mononucleares de sangue periférico, para a confecção de culturas in vitro em meio RPMI devidamente suplementado. Foram feitas uma cultura controle não-tratada (CON), culturas tratadas com cada extrato em três concentrações diferentes, além de uma cultura de células tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO), solvente usado na solubilização dos extratos vegetais. As culturas celulares foram incubadas por 24 horas a 37 °C e 5% de CO2. Após esse período, as células foram lavadas e avaliadas por citometria de fluxo ou por microscopia confocal. A presença de fluorescência interferente foi determinada com base em histogramas de intensidade de fluorescência feitos para oito intervalos de comprimento de onda distintos, tendo sido feitas análises quali e quantitativas dos dados. A fluorescência dos extratos vegetais e DMSO foram avaliadas isoladamente por fluorimetria, usando-se as mesmas concentrações utilizadas para as culturas celulares. Através da citometria de fluxo, foi identificado que o tratamento de linfócitos com qualquer um dos três extratos de plantas levou ao aparecimento de fluorescência interferente detectável em várias faixas de comprimento de onda. Culturas tratadas com DMSO não apresentaram fluorescência interferente. Pela fluorimetria foi visto que os extratos não emitem fluorescência, o que sugere que a fluorescência interferente foi induzida nas células após interações entre elas e os extratos. Este estudo levanta precauções que visam avaliar a possível presença de fluorescência interferente em condições de trabalho, possibilitando evitar esse viés e aumentar a confiabilidade dos resultados.
Infecções virais no sistema nervoso central em pacientes submetidos à internação hospitalar: investigação baseada em uma plataforma de “mini-arranjo” de PCR em tempo real singleplex
(UFVJM, 2021) Silva, Thyago José; Thomasini, Ronaldo Luis; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Thomasini, Ronaldo Luis; Costa, Sandra Cecília Botelho; Martins, Helen Rodrigues
As infecções no Sistema Nervoso Central (SNC) apresentam distribuição global e são importantes causas de morbidade e mortalidade. Estas infecções podem ser causadas principalmente por bactérias, fungos e vírus, sendo as infecções virais as mais frequentes. As etiologias das infecções virais no SNC mais frequentes são os enterovírus, herpesvirus, adenovírus e os arbovírus. No Brasil, entretanto, na maioria dos casos, o agente causador não é identificado. Métodos baseados em biologia molecular estão sendo cada vez mais aplicados no diagnóstico de doenças infeciosas. Assim, este estudo visou a aplicação de uma plataforma de “mini-arranjo” de Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qPCR) para a identificação de agentes virais causadores de infecções no SNC. Para tal, amostras de líquor de pacientes com suspeita de infecção viral internados no hospital Santa Casa de Caridade de Diamantina/MG no período de janeiro de 2019 a julho de 2021 foram coletadas e analisadas pela plataforma. Foram testadas 73 amostras, sendo que em 39 foram identificados material genético de vírus. Houve maior número de casos de Zika vírus (ZIKV) 27/73 (36,99%), seguido por Citomegalovírus (CMV) 5/73 (6,85%), Epstein-Barr vírus (EBV) 4/73 (5,48%), Herpesvirus Humano-6 (HHV-6) 4/73 (5,48%), Adenovírus (ADV) 4/73 (5,48%) e Enterovírus (ENTV) 4/73 (5,48%), Herpesvirus Humano-7 (HHV-7) 3/73 (4,11%), Herpes simples vírus 1/2 (HSV-1/2) e John Cunninghan vírus (JCV) 2/73 (2,74%). O Varicela-Zóster vírus (VZV), o Dengue vírus (DENV), o Chikungunya vírus (CHIKV) e também o Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 (SARS-CoV-2) não foram detectados em nenhuma das amostras analisadas. Foram detectados 9 casos de coinfecção entre o ZIKV, ADV, ENTV e os vírus da família Herpesviridae e 4 casos de coinfecção entre vírus e outros patógenos não virais. Nossos achados evidenciam a circulação de Zika vírus durante o período de coleta das amostras, além de reforçar a importância de se considerar este agente como causador de infecções no sistema nervoso central. A plataforma desenvolvida mostrou que pode ser útil para o diagnóstico de infecções virais no SNC e de utilidade para aplicação na rotina clínica laboratorial. Os resultados de testes moleculares precisam ser interpretados com cautela, especialmente, os que apresentam baixa carga viral. Sugere-se que determinação de carga viral com valores de corte definidos possam ser mais elucidativos que testes qualitativos.
Influência do tratamento com o diurético furosemida nas alterações biométricas, histológicas e nas respostas inflamatória, diurética e de proteinúria, em ratos com nefropatia induzida pela doxorrubicina
(UFVJM, 2021) Amaral, Bianca Lara Silva; Pereira, Wagner de Fátima; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Pereira, Wagner de Fátima; Esteves, Elizabethe Adriana; Santos, Sandro Luiz Barbosa dos
A síndrome nefrótica (SN) é uma nefropatia caracterizada por proteinúria maciça, hipoalbuminemia, edema generalizado e hiperlipidemia e pode ser de origem primária (idiopática) ou secundária. Em pacientes que apresentam edema devido à nefropatia, o diurético furosemida é um dos mais utilizados. Além disso, o possível papel da furosemida na resposta imunológica vem sendo cada vez mais estudado. Assim, a finalidade do presente estudo foi avaliar a influência do tratamento com o diurético furosemida em alterações biométricas, histológicas e nas respostas inflamatória, diurética e de proteinúria, de ratos com nefropatia induzida pela doxorrubicina (CEUA/UFVJM #001/2019). Foram utilizados 18 ratos Wistar machos, com peso médio de 180 gramas no início do experimento. Os animais foram divididos em 3 grupos experimentais: CONTROL – Grupo Controle Negativo (sem nefropatia e sem tratamento) (n=6). DOXO – Grupo Controle Positivo (com nefropatia e sem tratamento) (n=6). DOXO-F – Grupo Teste (com nefropatia e tratamento com Furosemida por via oral) (n=6). Nos dias 0, 7, 14, 21, 28 e 35 foi avaliado o consumo de água e realizada a coleta de urina dos animais para posteriores análises. No dia 37, todos os animais foram eutanasiados e coletou-se sangue, baço e rim para análises. Os animais do grupo DOXO-F apresentaram proteinúria, maior relação diurese/consumo de água 24h, aumento da massa esplênica, menor peso corporal, além de apresentar diminuição do número de glomérulos em relação ao grupo CONTROL Com relação à resposta imunológica, ocorreu maior leucometria devido ao aumento de neutrófilos, diminuição de TNF-α, aumento de TGF-β, aumento de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e proteína carbonilada, assim como de FRAP (Ferric- reducing ability of plasma), Superóxido Dismutase e Catalase. Estes resultados sugerem uma possível atuação da furosemida na tentativa de solucionar o processo inflamatório local, induzindo como consequência, um aumento da fibrose no tecido renal.
Investigação da relação entre a infecção pelo Herpesvírus humano tipo 7 (HHV-7) no comprimento telomérico relativo e associação com a síndrome de fragilidade e status sorológico para citomegalovírus e Epstein-Baar vírus
(UFVJM, 2023) Andrade, Sabrina dos Santos; Thomasini, Ronaldo Luis; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Thomasini, Ronaldo Luis; Bomfim, Fernando Russo Costa do; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de
O envelhecimento pode ser compreendido como um processo natural decorrente de modificações genéticas, bioquímicas e fisiológicas inerentes a todo ser humano. O envelhecimento pode ocorrer associado à síndrome de fragilidade, um estado com importante grau de morbidade e mortalidade para população idosa. Objetivo: investigar se há relação da infecção pelo HHV-7 com o grau de fragilidade em idosos e se existe correlação com o comprimento telomérico relativo e, com o status sorológico para o CMV e EBV. Metodologia: Estudo observacional, transversal, em amostras provenientes de um estudo multicêntrico, realizado em idosos. Os idosos foram categorizados em três subgrupos: não frágeis (robusto), pré-frágil e frágeis. A determinação dos níveis de IgG contra o citomegalovírus e Epstein-Baar foram realizadas através de Kits comerciais marca Serion ELISA Classic, conforme instruções do fabricante. Amostras de plasma foram obtidas por centrifugação de sangue periférico coletado por punção venosa usando um sistema de vácuo comercial com ácido etilenodiaminotetracético anticoagulante (EDTA). As reações de PCR foram realizadas usando o protocolo de detecção SYBR® Green no equipamento de PCR em tempo real StepOne ™ PLUS. Resultado: O comprimento telomérico relativo (CTR) de leucócitos totais não foi significativamente diferente entre os indivíduos classificados como frágeis, pré-frágeis e não-frágeis. As reações de PCR para avaliar a latência em leucócitos e células mononucleares a fim de comparar o CTR entre os grupos definidos como positivos e negativos, não mostraram diferenças significativas. O número de positivos para HHV-7 no plasma foi de 6,5% demonstrando que infecção ativa não foi frequente entre os voluntários da pesquisa e o CTRs não foi afetado quanto a esse fator. Houve correlação inversamente proporcional do título de IgG contra o CMV com o grau de fragilidade. Conclusões: O presente estudo não suporta a hipótese de influência causada pela infecção latente ou reativação do HHV-7 no grau de fragilidade, no comprimento telomérico de leucócitos totais ou células mononucleares e status sorológico do CMV e EBV. Não se encontrou evidência de correlação do grau de fragilidade com o comprimento telomérico de leucócitos totais ou células mononucleares.
Investigação de propriedades anti-inflamatórias do óleo de pequi (Caryocar brasiliense) em células mononucleares do sangue periférico humano
(UFVJM, 2022) Santos, Edivania Cordeiro dos; Esteves, Elizabethe Adriana; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Esteves, Elizabethe Adriana; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Rocha Vieira, Etel; Moreno, Lauane Gomes
O óleo de pequi (OP) é rico em nutrientes e compostos bioativos, especialmente ácido oleico, carotenoides e compostos fenólicos que, isoladamente, apresentam efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios em sistemas biológicos, indicando um potencial funcional para esse alimento. Entretanto investigações com o OP em células do sistema imunológico humano, ainda são escassas. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar efeitos anti-inflamatórios do OP em culturas de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC). Previamente, o perfil de ácidos graxos, o conteúdo de carotenoides e fenólicos totais foram determinados. Em seguida, a atividade antioxidante foi determinada pelos testes de captura do radical ABTS, capacidade antioxidante por varredura do radical DPPH e capacidade redutora do ferro. Por fim, utilizou-se culturas de PBMC obtidas a partir do sangue periférico de indivíduos adultos, hígidos e de ambos os sexos para os experimentos com células humanas. O OP foi testado em concentrações que variaram de 1 μg/mL a 1000 μg/mL. Previamente, avaliou-se a emissão de fluorescência interferente e a viabilidade celular. A proliferação de linfócitos e das subpopulações celulares CD4+ e CD8+ foi avaliada em culturas de 120 horas estimuladas pela fitohemaglutinina (PHA). As concentrações de interferon-γ (IFN-γ), interleucina (IL)-17, IL-2, IL-4, IL-10 e IL-6 foram determinadas em culturas de 4 horas. O OP apresentou alto conteúdo de ácido oleico, carotenoides e compostos fenólicos e demonstrou atividade antioxidante em todos os testes utilizados. O OP não induziu emissão de fluorescência interferente e não reduziu a viabilidade dos linfócitos. A concentração de 400 μg/mL de OP reduziu o índice de proliferação de linfócitos (p <0,05). Na concentração de 200 μg/mL, o OP reduziu o índice de proliferação de linfócitos e a subpopulação CD8+ (p <0,05), e reduziu as concentrações de IL-17, a IL-2 e de IL-4 (p <0,05). Portanto, o OP apresentou atividade antioxidante in vitro e potencial anti-inflamatório em culturas de PBMC já que reduziu a proliferação de linfócitos e a produção de mediadores pró-inflamatórios. É provável que o ácido oleico, carotenoides e fenólicos, sejam determinantes, pelo menos em parte, desses efeitos.
Miconia ferruginata DC. (Melastomataceae): estudo biomonitorado para triagem biológica de extratos e frações com atividade anticâncer
(UFVJM, 2021) Barroso, Poliana Ribeiro; Martins, Helen Rodrigues; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Martins, Helen Rodrigues; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Souza Fagundes, Elaine Maria de; Oliveira, Eduardo de Jesus; Rocha Vieira, Etel
As plantas medicinais são fontes riquíssimas de compostos bioativos, potenciais candidatos a novos medicamentos, especialmente para fármacos anticâncer. A utilização de novos agentes terapêuticos de origem natural tem revelado grande eficácia e oferece um amplo campo para investigação científica. Assim, o objetivo desta pesquisa foi realizar uma análise dos extratos e frações da espécie Miconia ferruginata, oriunda do Cerrado brasileiro, quanto ao seu potencial anticâncer. No estudo, foram realizadas avaliações de citotoxicidade (CL50 e CC50) e seletividade (IS) frente a diferentes linhagens tumorais, através da técnica colorimétrica pelo brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Em seguida, foi realizado o fracionamento biomonitorado para seleção das frações mais ativas e seletivas por meio da avaliação da citotoxicidade e análise da capacidade clonogênica. Além disso, para as frações ativas foram realizadas a caracterização do tipo de morte induzida por meio da análise da morfologia celular (coloração May Grunwald-Giemsa e Hoechst/Iodeto de Propídeo) e tipo de morte (necrose ou apoptose) pela marcação dupla por Anexina-V e Iodeto de Propídeo, bem como avaliação da sua possível interferência no ciclo celular. Os extratos etanólicos brutos das folhas, do caule, das inflorescências e da casca de M. ferruginata mostraram alta citotoxicidade para as células tumorais (IC50 de 18,5 a 96,0 μg/mL) associada a moderada toxicidade sobre células não-tumorais (CC50 > 216,1 μg/mL), refletindo diretamente no índice de seletividade observado (IS>2,3). O fracionamento foi orientado pelo biomonitoramento destes extratos por meio da partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. Das frações obtidas, as derivadas da fração acetato (FACL) e do resíduo aquoso do caule (FRCL) foram as mais citotóxicas e mais seletivas sobre as células tumorais, além de reduzirem a sua capacidade de proliferação e formação de colônias, sendo selecionadas para prosseguimento da investigação do potencial anticâncer. Foi observado claramente os aspectos morfológicos clássicos de apoptose, associado a interferência na progressão do ciclo celular com redução das fases S e G2/M e retenção na fase G0/G1. A fração FRCL reduziu tanto das fases G2/M quanto G0/G1 e induziu morte preferencialmente por necrose sobre as células THP-1. Desta forma, os dados obtidos neste estudo sugerem que o efeito citotóxico e antiproliferativo das frações ativas de M. ferruginata apresentam um mecanismo de morte celular misto, com indução de morte preferencialmente por apoptose, mas também podem ativar mecanismos via necrose para células resistentes a apoptose, atuando na inibição da proliferação in vitro. Esses resultados revelam que as frações podem ser candidatos terapêuticos para o desenvolvimento de fármacos para o tratamento de diferentes tipos de câncer, considerando sua atividade e seletividade.