Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio e da citotoxicidade in vitro mediada pelo sistema 2,4-pentanodiona/horseradish peroxidase/oxigênio

Abstract

O sistema ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy) é uma terapia antitumoral que envolve a ativação catalítica de um pró-fármaco, nas proximidades do sítio tumoral, por uma enzima conjugada a um anticorpo monoclonal com afinidade para antígenos específicos das células tumorais. O sistema composto pela enzima Horseradish peroxidase (HRP) e ácido indol-3-acético (IAA) tem sido estudado para o emprego na terapia ADEPT, e associado à indução de apoptose de células tumorais. A 2,4-pentanodiona (PD) também atua como substrato da HRP sendo oxidada por ela através de uma reação cuja cinética é semelhante à da catálise do IAA e, portanto, pode representar uma alternativa para essa terapia. Este trabalho teve como objetivo realizar uma avaliação da citotoxicidade mediada pelos produtos provenientes da oxidação da PD pela HRP frente a diferentes linhagens celulares, utilizando para isso diferentes metodologias que determinam a viabilidade celular como o azul de Trypan, MTT e vermelho neutro assim, como a análise microscópica das alterações celulares induzidas por esses sistemas; estabelecer uma comparação com a citotoxicidade mediada pela oxidação do IAA catalisada pela mesma enzima; verificar a incidência de morte celular por apoptose mediada pelos sistemas IAA/HRP/O2 e PD/HRP/O2; além de verificar a produção e os tipos de espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas pelos dois sistemas. Os experimentos permitiram evidenciar que as combinações PD/HRP/O2 e IAA/HRP/O2 levam a formação de ERO, sendo as espécies provavelmente formadas pela oxidação da PD o radical ânion superóxido e o peróxido de hidrogênio (H2O2) e pela oxidação do IAA o H2O2. Foi observado, somente para o IAA, um aumento na formação de ERO com o uso de uma maior concentração do substrato. Quanto ao estudo de viabilidade celular, esse permitiu evidenciar, através das três metodologias, o efeito citotóxico dos sistemas PD/HRP/O2 e IAA/HRP/O2, no entanto, o ensaio do MTT mostrou-se mais sensível para esse estudo. A oxidação do IAA pela HRP induziu apoptose, contudo não foi possível identificar o tipo de morte celular mediada pelo sistema PD/HRP/O2, provavelmente devido a um problema técnico durante algumas análises em citometria de fluxo, o Quenhcing. Apesar de o sistema IAA/HRP/O2 ter apresentado uma destruição celular mais expressiva, o substrato IAA quando testado na ausência da enzima mostrou-se tóxico, o que não foi visto para a PD quando testada nas concentrações de 1; 1,5 e 2 mM, o que a torna um bom substrato para o emprego na terapia ADEPT.