PPGBIO - Mestrado em Biocombustíveis (Dissertações)
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Item Otimização da produção de amilases por Rhizopus arrhizus I 1.2.1 e hidrólise do amido dos grãos de milho(UFVJM, 2022) Lopes, Paulo Henrique Silva; Nelson, David Lee; Benassi, Vivian Machado; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Nelson, David Lee; Baffi, Milla Alves; Lucas, Rosymar Coutinho deA hidrólise do polímero de amido é realizado pelo sistema amilolítico, formando diferentes produtos de hidrólise, como a glicose e a maltose. Essas enzimas são, principalmente, sintetizadas por microrganismos, em especial, fungos filamentosos, no entanto, é necessário otimizar os processos de produção e uso das enzimas para tornar os processos de hidrólise mais viáveis. O objetivo desse trabalho foi otimizar a produção das amilases por Rhizopus arrhizus I 1.2.1 e caracterizar bioquimicamente as amilases, bem como realizar a hidrólise do amido de milho para liberação de açúcares passíveis de fermentação. Realizou-se a identificação molecular e filogenética do fungo, além das melhores condições de cultivo. Os parâmetros analisados foram o meio de cultivo e tempo de maior produção enzimática, fonte de nitrogênio, sais, pH inicial do meio de cultivo, tamanho do inóculo em disco, fonte de carbono e suplementação com glicose, além da caracterização das amilases brutas e a aplicação na hidrólise de diferentes substratos. Identificou-se que a cepa analisada pertence à espécie Rhizopus arrhizus, cuja produção enzimática foi otimizada de 0,12 para 22,50 U.mL-¹, com 6 dias de cultivo em meio submerso Carvalho-Peixoto, a 35ºC, de forma estacionária, em presença de ureia, pH inicial 6,0, inóculo em disco de 0,5'' e casca de abacaxi acrescida de glicose. As amilases brutas apresentaram atividade ótima aparente a 60ºC e pH 6,0 (17,5 U.mL-¹), com termoestabilidade por até 240 minutos entre 50 e 55ºC. Além de que sais contendo sulfato e potássio aumentaram a ação catalítica em 26%. As enzimas foram capazes de hidrolisar diferentes substratos, bem como os grânulos de amido presentes nos grãos de milho em temperaturas abaixo do seu ponto de gelatinização, como foi observado pela presença de cavidades nas micrografias superficiais dos grânulos e pela cinética de hidrólise com a liberação de até 0,443 mg de açúcares redutores em 24 horas e sem otimização. Pelo exposto, o estudo demonstrou potencial aplicabilidade para a produção de amilases, uma vez que se utilizou fonte residual de carbono, fonte de nitrogênio relativamente barata, e menor gasto de reagentes químicos na formulação do meio de cultivo e inóculo. Além disso, as amilases produzidas demonstraram ser capazes de hidrolisar os grânulos de amido presentes no milho numa temperatura mais baixa que a utilizada a nível industrial, indicando menor gasto energético na liberação dos açúcares fermentescíveis essenciais na produção do etanol de milho.Item Mutagênese clássica e melhoramento do perfil de assimilação de nitrogênio para a produção de amilase por Talaromyces trachyspermus(UFVJM, 2016) Veron, Nahyara Wandscheer; Vanzéla, Ana Paula de Figueiredo Conte; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Vanzéla, Ana Paula de Figueiredo Conte; Melo, Verônica Ferreira; Nelson, David Lee; Sivieri, Rúbia Regina GonçalvesAs α-amilases são essenciais para a hidrólise industrial do amido e para a produção de etanol a partir de biomassas amiláceas. Sua obtenção via importação impacta negativamente a indústria de biocombustíveis no Brasil, de modo que é preciso impulsionar a produção de α-amilases no mercado interno. Este trabalho teve por objetivo caracterizar e melhorar o perfil de utilização de fontes de nitrogênio por Talaromyces trachyspermus, um ascomiceto filamentoso, bem como apontar o efeito dessas fontes na produção de α-amilase por processos submersos delineados por planejamento fatorial. Empregando mutagênese com luz ultravioleta, foram induzidos e selecionados mutantes com perfil para a produção de α-amilase a partir de fontes nitrogenadas mais baratas. A linhagem parental T. trachyspermus T10.5 utilizou todas as fontes de nitrogênio avaliadas (extrato de levedura, glutamato, glutamina, ureia, sulfato de amônio e nitrato de sódio) mas a produção de α-amilase foi inibida nos bioprocessos suplementados com fontes inorgânicas (sulfato de amônio e nitrato de sódio). A análise do planejamento fatorial mostrou que extrato de levedura apresentou efeito estatístico positivo (4,16 após 72 h e 8,93 após 96 h de cultivo) para a produção de α-amilase pela linhagem parental, cuja produção atingiu 66,67 ± 0,18 U/mL após 96h em meio suplementado com o nível mais elevado de extrato de levedura (3,7 g/L). Um ensaio de gel atividade e eletroforese protéica confirmaram a presença de uma enzima amilolítica no filtrado, com peso molecular aproximado de 20 kDa. Dois mutantes foram selecionados: M12 e M15. A análise estatística apontou um efeito positivo do extrato de levedura (5,05 após 48h e 104,8 após 72 h de cultivo) para a produção de α-amilase pelo mutante M12, que produziu 55,3 ± 0,2 U/mL após 72 h. O mutante M12 produziu α-amilase com atividade próxima à do parental, mas o máximo de produção ocorreu 24 h antes. Ambos os mutantes produziram α-amilase em meio suplementado com fontes inorgânicas de nitrogênio, mas a produção da linhagem M12 foi mais expressiva: 29,5 ± 0,2 U/mL após 72 h em meio suplementado com sulfato de amônio. Assim, foram melhorados o perfil de assimilação de nitrogênio e a produção de amilase a partir de fonte mais econômica, bem como foi reduzido o tempo de produção. Os resultados permitiram compreender o efeito das fontes de nitrogênio e de carbono na produção de amilase por T. trachyspermus, gerando conhecimentos sobre fisiologia fúngica, que serão posteriormente aplicados para a otimização da produção pelas linhagens T10.5 e M12.