PPGBIO - Mestrado em Biocombustíveis (Dissertações)

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Bioprospecção de fungos amilolíticos e caracterização bioquímica da amilase de Mucor sp. AD742 visando aplicação na hidrólise do amido
(UFVJM, 2019) Almeida, Aline Cristina de; Benassi, Vivian Machado; Lucas, Rosymar Coutinho de; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Benassi, Vivian Machado; Reis, Arlete Barbosa dos; Oliveira, Tassio Brito de
Os micro-organismos apresentam a capacidade de produzir diversos metabólitos, que são largamente utilizados em processos biotecnológicos, incluindo os catalisadores biológicos denominados de enzimas. Dentre as enzimas hidrolíticas, as amilases destacam-se por promoverem a quebra do amido em açúcares que são passíveis de utilização no processo de obtenção de etanol a partir da mandioca, por exemplo. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar morfologicamente e microscopicamente os fungos filamentosos coletados em distintas áreas, verificar a influência da temperatura no crescimento dos isolados, bem como otimizar os parâmetros físico-químicos do cultivo do Mucor sp. AD742 para uma maior produção amilolítica, além de caracterizar bioquimicamente a enzima em estudo, além de analisar a hidrólise de distintas amostras de amido para verificação da formação de açúcares passíveis de fermentação. Para tanto, foram coletadas amostras nas cidades de Diamantina e Conceição do Mato Dentro (MG), as quais foram inoculadas em meio sólido, à 30°C, para o crescimento e isolamento de fungos filamentosos, sendo as amostras analisadas até o quinto dia de crescimento, realizando o repique pontual para a caracterização dos isolados. A identificação do possível gênero dos micro-organismos foi realizada em câmara de microcultivo, utilizando-se o meio sólido composto de aveia e ágar, à 30ºC. Para a análise da termofilia, cada isolado foi cultivado no meio de cultura sólido Batata-Dextrose-Ágar (BDA), e a taxa de crescimento em centímetros foi avaliada por hora nas temperaturas de 30ºC, 35ºC, 40ºC, 50ºC e 55ºC. Selecionaram-se dez isolados para a indução da produção de amilase em meio de cultura líquido CP, durante oito dias, na melhor temperatura de cada fungo, cuja atividade amilolítica foi avaliada por meio da formação de açúcares redutores. Foi realizada a otimização dos parâmentos físico-químicos para cultivo do fungo filamentoso Mucor sp. AD742, tais como: meio de cultivo e tempo de crescimento fúngico, análise da solução de sais, fonte de nitrogênio, fonte de carbono, e pH inicial do meio de cultivo para uma maior atividade enzimática. Assim como, caracterizou-se o pH e a temperatura ótima de ensaio enzimático utilizando-se o Planejamento Fatorial – Delineamento Composto Central Rotacional, com dois pontos axiais (DCCR2) avaliando as temperaturas de 43ºC à 75ºC, e os pHs de 4,2 à 7,8. Em relação à estabilidade à temperatura, analisou-se a manutenção da atividade da enzima até 120 minutos nas temperaturas de 50ºC, 55ºC e 60ºC, bem como a estabilidade aos pH de 4,5 a 7,0 durante 2 horas. A prospecção resultou em quarenta e oito fungos filamentosos isolados com aspectos morfológicos aparentemente diferentes. Na análise do micro-cultivo foi possível identificar estruturas morfológicas representativas possivelmente dos gêneros Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Rhizoctonia e Mucor. Os isolados da área do lixão, AL131 e AL221, apresentaram maior taxa de crescimento à 30°C, enquanto os isolados AD742 e AQ832 apresentaram os maiores valores de atividade enzimática. Os resultados da otimização dos parâmetros de cultivo mostraram que a casca de banana como fonte de carbono, extrato de levedura como fonte de nitrogênio, pH inicial 5,5 do meio e sais SR se mostraram mais eficientes. Quando analisadas as melhores condições de reação observamos que o pH 5,5 e a temperatura de 65°C se apresentaram como melhores condições. Em relação à estabilidade à temperatura, pode-se observar que a enzima se manteve estável nas temperaturas de 50ºC, 55ºC e 60ºC, durante 120 minutos de reação, observando um decaimento de 60% da atividade após 2 horas à 60ºC, enquanto que nos outros tempos e temperaturas a mesma manteve 50% da atividade amilolítica. Quanto à estabilidade ao pH, observou-se uma manutenção de mais de 50% da atividade enzimática em todos os tempos e pH analisados. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a prospecção em ambientes com alta taxa de decomposição é um método eficiente para a obtenção de novos fungos produtores de enzimas importantes nos processos industriais, além disso, a otimização de parâmetros relacionados ao crescimento desses micro-organismos, tais como fontes nutricionais, temperatura, pH, entre outros, favorece o aumento da atividade das enzimas prospectadas.
Codigestão anaeróbia de vinhaça de etanol e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado biologicamente por ensilagem: um estudo da produção de biogás
(UFVJM, 2022) Dayrell, Ludimila Rodrigues; Nelson, David Lee; Reis, Arlete Barbosa dos; Benassi, Vivian Machado; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Nelson, David Lee; Santos, Sandro Luiz Barbosa dos; Meira Pires, Juliana Rocha de
A emissão de Gases do Efeito Estufa (GEEs) contribui significativamente com as mudanças climáticas. A necessidade de mitigar tais emissões impulsiona a busca por fontes alternativas de energia. O setor sucroalcooleiro é responsável pela produção de etanol, um dos biocombustíveis que contribui significativamente para a redução nas emissões de CO2 e representa um importante agronegócio no Brasil. Contudo, em sua cadeia produtiva são gerados resíduos que necessitam de tratamento e destinação adequados. Nesse contexto, esta pesquisa teve como objetivo avaliar a codigestão anaeróbia de vinhaça de etanol e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado biologicamente por ensilagem, para geração de biogás e redução da toxicidade dessas biomassas. Após o pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar, foram observadas reduções médias de aproximadamente 15 % e 10 % nos teores de celulose e hemicelulose, o que representou um aumento de 48 % na produtividade média de biogás dos sistemas alimentados com vinhaça de etanol e silagens de bagaço umedecido com digestato e ensilado por períodos de 30 e 60 dias, além da redução de 80 % na demanda química de oxigênio, observou-se também que a relação média de carbono:nitrogênio nos sistemas em codigestão foi de 29:1, enquanto foi de 45:1 nos biodigestores alimentados com silagem e de 17:1, quando alimentados com vinhaça. Então, podemos concluir que embora o pré-tratamento de biomassas lignocelulósicas por ensilagem seja brando, em codigestão com a vinhaça de etanol obteve-se maior rendimento de biogás, corroborando com o ideal de sustentabilidade da cadeia sucroalcooleira do Brasil e redução das emissões dos GEE’s.
Otimização da produção de amilases por Rhizopus arrhizus I 1.2.1 e hidrólise do amido dos grãos de milho
(UFVJM, 2022) Lopes, Paulo Henrique Silva; Nelson, David Lee; Benassi, Vivian Machado; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Nelson, David Lee; Baffi, Milla Alves; Lucas, Rosymar Coutinho de
A hidrólise do polímero de amido é realizado pelo sistema amilolítico, formando diferentes produtos de hidrólise, como a glicose e a maltose. Essas enzimas são, principalmente, sintetizadas por microrganismos, em especial, fungos filamentosos, no entanto, é necessário otimizar os processos de produção e uso das enzimas para tornar os processos de hidrólise mais viáveis. O objetivo desse trabalho foi otimizar a produção das amilases por Rhizopus arrhizus I 1.2.1 e caracterizar bioquimicamente as amilases, bem como realizar a hidrólise do amido de milho para liberação de açúcares passíveis de fermentação. Realizou-se a identificação molecular e filogenética do fungo, além das melhores condições de cultivo. Os parâmetros analisados foram o meio de cultivo e tempo de maior produção enzimática, fonte de nitrogênio, sais, pH inicial do meio de cultivo, tamanho do inóculo em disco, fonte de carbono e suplementação com glicose, além da caracterização das amilases brutas e a aplicação na hidrólise de diferentes substratos. Identificou-se que a cepa analisada pertence à espécie Rhizopus arrhizus, cuja produção enzimática foi otimizada de 0,12 para 22,50 U.mL-¹, com 6 dias de cultivo em meio submerso Carvalho-Peixoto, a 35ºC, de forma estacionária, em presença de ureia, pH inicial 6,0, inóculo em disco de 0,5'' e casca de abacaxi acrescida de glicose. As amilases brutas apresentaram atividade ótima aparente a 60ºC e pH 6,0 (17,5 U.mL-¹), com termoestabilidade por até 240 minutos entre 50 e 55ºC. Além de que sais contendo sulfato e potássio aumentaram a ação catalítica em 26%. As enzimas foram capazes de hidrolisar diferentes substratos, bem como os grânulos de amido presentes nos grãos de milho em temperaturas abaixo do seu ponto de gelatinização, como foi observado pela presença de cavidades nas micrografias superficiais dos grânulos e pela cinética de hidrólise com a liberação de até 0,443 mg de açúcares redutores em 24 horas e sem otimização. Pelo exposto, o estudo demonstrou potencial aplicabilidade para a produção de amilases, uma vez que se utilizou fonte residual de carbono, fonte de nitrogênio relativamente barata, e menor gasto de reagentes químicos na formulação do meio de cultivo e inóculo. Além disso, as amilases produzidas demonstraram ser capazes de hidrolisar os grânulos de amido presentes no milho numa temperatura mais baixa que a utilizada a nível industrial, indicando menor gasto energético na liberação dos açúcares fermentescíveis essenciais na produção do etanol de milho.
Padronização do cultivo do fungo filamentoso isolado A4 para produção de lipases
(UFVJM, 2020) Costa, Tatiana Paula; Benassi, Vivian Machado; Pinto, Nísia Andrade Villela Dessimoni; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Nelson, David Lee; Benassi, Vivian Machado; Reis, Arlete Barbosa dos; Pires, Juliana Rocha de Meira
Enzimas produzidas por fungos filamentosos têm demonstrado amplas aplicações biotecnológicas nos mais diversos segmentos industriais. Para suprimento dessa demanda, há uma crescente busca por novas linhagens de fungos produtores dessas enzimas, levando ao isolamento e seleção a partir dos mais diferentes biomas. Esse trabalho objetivou analisar a temperatura dos fungos filamentosos, selecionar um fungo filamentoso potencialmente capaz de produzir lipase e otimizar a produção da enzima pelo micro-organismo selecionado. Inicialmente foi analisado a temperatura de crescimento de vinte e um fungos filamentosos do laboratório em meio Aveia e meio BDA, a fim de verificar a melhor temperatura de crescimento de cada micro-organismo. Os fungos em meio aveia com maiores taxas de crescimento a diferentes temperaturas foram o 3.8TA, P3, MB2.9, MB2.12, 4.2 e B8, e em meio BDA foram o 3.8TA, P3, M2.3, C421, B8, 4.2 e A4. Os vinte e um fungos foram testados quanto a sua capacidade de produção de lipases em meio contendo Tween® 80, sendo que destes micro-organismos dois (M1.1 e A4) apresentaram halo de atividade lipolítica quando utilizado a solução reveladora, optando-se pelo fungo A4 para prosseguir com o trabalho. Em seguida, o fungo filamentoso A4 foi incubado em quatro meios submersos distintos (Vogel, Adams, Khanna, e SR), à 30 ºC, em estufa bacteriológica, de forma estacionária, durante oito dias e retirados a cada vinte e quatro horas, sendo o meio que apresentou uma melhor atividade lipolítica o Khanna (2,32 U.mL-1) após 120 horas de cultivo. Após definir o meio de cultivo submerso, variou-se sua composição, analisando fonte de nitrogênio (extrato de levedura, peptona, ureia, nitrato de potássio e suas combinações). Para a fonte de nitrogênio o melhor valor de atividade lipolítica obtido foi 2,15 U.mL-1 (ureia + peptona + KNO3) pelo fungo filamentoso A4. Em seguida, foram analisadas diferentes fontes de sais (sais Vogel, sais CP, sais SR e suas combinações), estabelecendo a suplementação do meio com sais Vogel. Analisou-se, também, o efeito da variação do pH inicial do meio de cultura (pH iniciais 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 e 6,0), determinando o 4,5 como ideal para crescimento do isolado A4 e produção de lipases. Por fim, analisou-se a influência de diferentes óleos (soja, milho, girassol, dendê e algodão) como fonte de carbono, e o fungo A4 apresentou uma melhor atividade enzimática em meio de cultura suplementado com óleo de algodão (171,36 U.mL-1). Esses resultados demonstram a importância da seleção de fungos filamentosos como recurso biotecnológico, em especial para a produção de enzimas lipolíticas. A otimização resultou em um aumento na produção da enzima, abrindo perspectivas para a otimização do processo de fermentação submersa utilizando processos de baixo custo.
Produção e caracterização bioquímica de xilanases produzidas pelo fungo isolado EA 1.3.1.
(UFVJM, 2019) Marinho, Gessica Oliveira; Benassi, Vivian Machado; Nelson, David Lee; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Benassi, Vivian Machado; Roa, Juan Pedro Bretas; Brito, Tássio Oliveira
As biotecnologias relacionadas com as energias renováveis, tais como os biocombustíveis obtidos de fontes residuais, de baixo custo, e que representam tecnologias limpas, tornaram uma solução para os problemas ambientais. Assim, objetivou-se desenvolver um bioprocesso para obtenção de um extrato rico em xilanases fúngicas, determinando seus parâmetros físico-químicos de cultivo do microrganismo, além de caracterizar bioquimicamente o extrato bruto obtido. A otimização da produção xilanolítica foi obtida analisando o desenvolvimento do fungo diante das variações dos recursos disponíveis e com análise bioquímica do extrato bruto. Variou-se os meios de cultivo e tempo de crescimento, fonte de nitrogênio, de carbono, solução de sais, concentração de esporos e pH inicial do meio. A atividade xilanásica foi determinada pela formação dos açúcares redutores pela hidrólise do substrato xilana beechwood 1% (m/v) em tampão acetato de sódio 100 mM, pH 5,5, à 55 ºC, utilizando-se o ácido 3’,5’dinitrosalicílico como agente colorimétrico. A produção xilanolítica máxima foi obtida pelo fungo EA 1.3.1 em meio de cultura líquido Khanna enriquecido com solução de sais CP, durante quatro dias de forma estacionária, utilizando-se extrato de levedura como fonte de nitrogênio. A produção xilanolítica apresentou maiores níveis de atividade quando o microrganismo foi cultivado em meio contendo farelo de trigo com 25,63 U.mL quando comparada com as outras fontes testadas. Vale citar que, a palha de cana-de-açúcar e semente de abóbora também favoreceram a síntese enzimática e, portanto, podem ser utilizadas como fontes alternativas para a produção de xilanases. O pH inicial do meio de cultivo foi de 8,5 e a concentração ideal de inóculo tem ordem de grandeza de 10 esporos/mL. Após a otimização de cultivo, realizou-se a caracterização bioquímica das xilanases, observando-se que a temperatura e pH ideais de ensaio enzimático foram 65 °C e 6,5, respectivamente. Visualizou-se que à 50 °C o extrato enzimático apresentou-se estável, perdendo apenas 8% da sua atividade após 90 minutos de incubação e diminuindo sua atividade com exposição a temperaturas mais elevadas. As enzimas se apresentaram estáveis à pH 5,0, durante 90 minutos. Concluiu-se, assim, que o fungo isolado demonstrou elevada atividade xilanolítica, podendo ser produzido com custo reduzido, devido às fontes de carbono de baixo custo, além de apresentarem características importantes em processos industriais, como atividade enzimática em ampla faixa de temperatura e pH e estabilidade a temperatura.
Síntese de biodiesel, glicerol, solketal e éter de solketal
(UFVJM, 2018) Pereira, Adeline Cristina; Santos, Sandro Luiz Barbosa dos; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Santos, Sandro Luiz Barbosa dos; Benassi, Vivian Machado; Hurtado, Gabriela Ramos
O catalisador denominado SiO2-SO3H foi empregado em três processos reacionais distintos: transesterificação, cetalização e eterificação. Utilizado em uma proporção de 20% (m/m) contendo tolueno, o SiO2-SO3H se mostrou muito eficiente no processo de transesterificação de triacilglicerídeos fornecendo glicerol e ésteres metílicos de ácidos graxos (biodiesel) com um rendimento de 98%. Empregou-se o glicerol obtido como reagente em uma mistura com acetona, em um meio reacional livre de solventes e utilizando o SiO2-SO3H, obteve-se conversão total e 100% de seletividade para o composto contendo o anel de 5 membros [(±)- 2,2-Dimetil-4-hidroximetil-1,3-dioxolano] conhecido como solketal, um produto químico versátil, com diversas aplicações, na indústria de cosmético e farmacêutica, além de aditivo para diesel com a finalidade de reduzir o ponto de congelamento, melhorar as propriedades lubrificantes e aumentar a potência anti-detonante. Posteriormente realizou-se o processo de eterificação do solketal, empregando o catalisador SiO2-SO3H, levando a formação do 4,4'-[oxibis(metileno)]-bis(2,2-dimetil-1,3-dioxolano)], “éter de di-solketal”, precursor do diglicerol, importante emulsificante das indústrias farmacêutica e alimentícia com 98% de rendimento. A eterificação do solketal foi também promovida empregando o catalisador denominado SiO2-Nb levando a formação do 4,4'-[oxibis(metileno)]-bis(2,2-dimetil-1,3-dioxolano)], “éter de di-solketal” com um rendimento de 96%.