Eletrossíntese, caracterização e aplicação de filmes poliméricos de poli(ácido 2-hidroxicinâmico) em imunossensores impedimétricos para diagnóstico de leishmaniose visceral em amostras de soros caninos

Abstract

A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é considerada um problema de saúde pública causada por um protozoário do gênero Leishmania que acomete cães, o qual no ciclo urbano de transmissão é o principal reservatório. Neste trabalho, investigou-se o desenvolvimento de um imunossensor impedimétrico sobre eletrodos de grafite (EG) e eletrodos impressos de óxido de grafeno (EIG) modificados com filmes poliméricos para detecção de Leishmaniose infantum em amostras de soros caninos. Os EG e o EIG foram modificados pela eletrodeposição do ácido 2-hidroxicinâmico (2-HCA). A eletropolimerização do 2-HCA foi realizada por voltametria cíclica (VC), utilizando-se solução monomérica 2,50 mM preparada em H2SO4 0,50 M contendo 1,0 mL de etanol. Para o EG utilizou-se 100 ciclos de potencial na faixa de +0,20 a +1,20 V a 50 mV/s e para o EIG 15 ciclos consecutivos de potencial de 0,00 a +1,00V a 100 mV/s. Para ambos os eletrodos modificados o poli(2-HCA) apresentou características adsortivas e eletroativas. Estudos de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) foram realizados para avaliar as propriedades elétricas dos eletrodos modificados. Para o EG/2-HCA utilizou-se o circuito equivalente descrito como (Rs(RQp)(Qdl[RtcW]) onde obteve-se o valor de resistência a transferência de carga (Rtc) de 13,2 kΩ, enquanto que para EIG/2-HCA o circuito equivalente proposto foi o de Randles, no qual o valor de Rtc foi de 4,2 kΩ. Visando a miniaturização do sistema, optou-se pelo desenvolvimento do biossensor sobre os EIG. Desta forma, foram colocados sobre a superfície dos EIG/2-HCA, utilizando a técnica de adsorção, 35 µL de diferentes concentrações do antígeno L. infantum (Ag) (15, 30, 50, 70 e 100 µg/mL), sendo realizados testes de interação com amostras de soros caninos contendo os anticorpos positivos (Ac+) de L. infantum em diferentes proporções 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1280 diluídos em tampão HBS-EP pH 7,40 com 20 minutos de interação a 37 °C. Os melhores resultados foram obtidos utilizando-se o antígeno em concentração de 50 µg/mL durante 20 min a 37 ºC e a diluição do soro de 1:320. Posteriormente, avaliou-se o tempo de imobilização do Ag e de imunorreação Ag-Ac em 20, 40 e 60 minutos. Obteve-se 20 min de como tempo ideal de imobilização de Ag e para imunorreação Ag-Ac+. Após otimização destes parâmetros, avaliou-se a resposta do imunossensor na presença de amostras de soros caninos diagnosticados como positivos (Ac+) e negativos (Ac-) para Leishmaniose infantum, onde observou-se valores de Rtc para o sistema Ag-Ac+ 82% maior do que o obtido para o Ag-Ac-, demonstrando margem de segurança confiável no reconhecimento do analito de interesse. O imunossensor proposto para detecção de Leishmaniose infantum apresentou boas perspectivas para aplicação ao diagnóstico da doença, podendo-se tornar mais uma alternativa para realização de testes rápidos e de simples aplicação para detecção de LVC.