Bioprospecção de fungos amilolíticos e caracterização bioquímica da amilase de Mucor sp. AD742 visando aplicação na hidrólise do amido

Abstract

Os micro-organismos apresentam a capacidade de produzir diversos metabólitos, que são largamente utilizados em processos biotecnológicos, incluindo os catalisadores biológicos denominados de enzimas. Dentre as enzimas hidrolíticas, as amilases destacam-se por promoverem a quebra do amido em açúcares que são passíveis de utilização no processo de obtenção de etanol a partir da mandioca, por exemplo. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar morfologicamente e microscopicamente os fungos filamentosos coletados em distintas áreas, verificar a influência da temperatura no crescimento dos isolados, bem como otimizar os parâmetros físico-químicos do cultivo do Mucor sp. AD742 para uma maior produção amilolítica, além de caracterizar bioquimicamente a enzima em estudo, além de analisar a hidrólise de distintas amostras de amido para verificação da formação de açúcares passíveis de fermentação. Para tanto, foram coletadas amostras nas cidades de Diamantina e Conceição do Mato Dentro (MG), as quais foram inoculadas em meio sólido, à 30°C, para o crescimento e isolamento de fungos filamentosos, sendo as amostras analisadas até o quinto dia de crescimento, realizando o repique pontual para a caracterização dos isolados. A identificação do possível gênero dos micro-organismos foi realizada em câmara de microcultivo, utilizando-se o meio sólido composto de aveia e ágar, à 30ºC. Para a análise da termofilia, cada isolado foi cultivado no meio de cultura sólido Batata-Dextrose-Ágar (BDA), e a taxa de crescimento em centímetros foi avaliada por hora nas temperaturas de 30ºC, 35ºC, 40ºC, 50ºC e 55ºC. Selecionaram-se dez isolados para a indução da produção de amilase em meio de cultura líquido CP, durante oito dias, na melhor temperatura de cada fungo, cuja atividade amilolítica foi avaliada por meio da formação de açúcares redutores. Foi realizada a otimização dos parâmentos físico-químicos para cultivo do fungo filamentoso Mucor sp. AD742, tais como: meio de cultivo e tempo de crescimento fúngico, análise da solução de sais, fonte de nitrogênio, fonte de carbono, e pH inicial do meio de cultivo para uma maior atividade enzimática. Assim como, caracterizou-se o pH e a temperatura ótima de ensaio enzimático utilizando-se o Planejamento Fatorial – Delineamento Composto Central Rotacional, com dois pontos axiais (DCCR2) avaliando as temperaturas de 43ºC à 75ºC, e os pHs de 4,2 à 7,8. Em relação à estabilidade à temperatura, analisou-se a manutenção da atividade da enzima até 120 minutos nas temperaturas de 50ºC, 55ºC e 60ºC, bem como a estabilidade aos pH de 4,5 a 7,0 durante 2 horas. A prospecção resultou em quarenta e oito fungos filamentosos isolados com aspectos morfológicos aparentemente diferentes. Na análise do micro-cultivo foi possível identificar estruturas morfológicas representativas possivelmente dos gêneros Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Rhizoctonia e Mucor. Os isolados da área do lixão, AL131 e AL221, apresentaram maior taxa de crescimento à 30°C, enquanto os isolados AD742 e AQ832 apresentaram os maiores valores de atividade enzimática. Os resultados da otimização dos parâmetros de cultivo mostraram que a casca de banana como fonte de carbono, extrato de levedura como fonte de nitrogênio, pH inicial 5,5 do meio e sais SR se mostraram mais eficientes. Quando analisadas as melhores condições de reação observamos que o pH 5,5 e a temperatura de 65°C se apresentaram como melhores condições. Em relação à estabilidade à temperatura, pode-se observar que a enzima se manteve estável nas temperaturas de 50ºC, 55ºC e 60ºC, durante 120 minutos de reação, observando um decaimento de 60% da atividade após 2 horas à 60ºC, enquanto que nos outros tempos e temperaturas a mesma manteve 50% da atividade amilolítica. Quanto à estabilidade ao pH, observou-se uma manutenção de mais de 50% da atividade enzimática em todos os tempos e pH analisados. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a prospecção em ambientes com alta taxa de decomposição é um método eficiente para a obtenção de novos fungos produtores de enzimas importantes nos processos industriais, além disso, a otimização de parâmetros relacionados ao crescimento desses micro-organismos, tais como fontes nutricionais, temperatura, pH, entre outros, favorece o aumento da atividade das enzimas prospectadas.