Otimização dos parâmetros de eletropolimerização do ácido 4-hidroxifenilacético para utilização no desenvolvimento de genossensores aplicados na detecção de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Foi otimizada a eletropolimerização do ácido 4-hidroxifenilacético (4-HFA), visando sua aplicação como plataforma funcionalizada para imobilização de biomoléculas, para o desenvolvimento de genossensores. Foi utilizado o monômero 4-HFA, e por meio deste a eletrogeração foi conduzida sobre a superfície do eletrodo de grafite (EG), utilizando-se a técnica de voltametria cíclica na faixa de +0,0 a +1,20 V, onde foram investigados dois parâmetros: número de ciclos de potencial aplicado e velocidade de varredura utilizada. Associado a este estudo, foi investigado a imobilização de pequenos fragmentos de DNA (oligonucleotídeos), observando a atuação da plataforma funcionalizada na resposta do biossensor para detecção dos oligonucleotídeos, bem como avaliação do reconhecimento do evento de hibridização com o alvo complementar. Observou-se que o filme polimérico formado apresentou um par redox na região +0,53/+0,38 V e o aumento do número de ciclos gera plataformas mais eletroativas devido a maior quantidade de material adsorvido, por outro lado, a diminuição da velocidade de varredura gera plataformas mais eletroativas devido a ocorrência do acoplamento mais organizado. Medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) mostraram maior resistência do filme para os eletrodos modificados com maior número de ciclos, bem como para os eletrodos modificados com maiores velocidades de varredura. Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostraram que em todos os casos não há total recobrimento da superfície do EG e corroboraram com os demais resultados encontrados. As imagens de MEV demonstraram que diferentes ciclagens não influenciam na morfologia do filme formado, mas sim na quantidade de material adsorvido. Por outro lado, as imagens também mostraram que as diferentes velocidades de varredura geram filmes com morfologias distintas. A plataforma EG/poli(4-HFA) mostrou-se eficiente e sensível para a imobilização de oligonucleotídeos, bem como para o evento de hibridização com o oligonucleotídeo complementar. O eletrodo que apresentou as melhores respostas para imobilização das ssDNAs estudadas e detecção dos respectivos alvos complementares foi o eletrodo modificado com 100 ciclos de potencial na velocidade de varredura de 75 mV/s, uma vez que mostrou maiores amplitudes nos valores de corrente de pico. A construção do genossensor para detecção do bacilo Mycobacterium tuberculosis confirmou os demais resultados acerca da eficiência da plataforma EG/poli(4-HFA), uma vez que a mesma demonstrou excelente sensibilidade ao utilizar o Azul de Metileno (AM) como intercalador. O genossensor desenvolvido apresentou um excelente limite de detecção de 0,16 nmol, operando com volumes baixíssimos de solução, sendo estes 15 µL de sonda MYC e 10 µL de alvo MYC. Foi possível desenvolver o dispositivo e ainda otimizar vários parâmetros de adsorção da sonda e hibridização do alvo, o que ocasionou uma melhoria da diminuição do sinal de redução do AM de 14% para 34%. Em adição, estudos com o interferente MYC-NE demonstraram que o genossensor possui seletividade satisfatória, uma vez que a hibridização com o interferente acarretou em diminuição do sinal 46% inferior quando comparado ao alvo específico.