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Indução de fluorescência interferente em culturas de linfócitos humanos pelo tratamento com três extratos vegetais
(UFVJM, 2017) Ottoni, Marcelo Henrique Fernandes; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Pereira, Wagner de Fátima; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Sampaio, Kinulpe Honorato; Carvalho Júnior, Álvaro Dutra de
A presença de fluorescência interferente em uma dada amostra é considerada como um importante problema em métodos fluorimétricos, devido à possível sobreposição espectral entre ela e a emissão fluorescente de sondas. Por isso, é importante conhecer se há fluorescência interferente em uma dada amostra e substâncias de interesse nas condições de trabalho pretendidas. No presente estudo, foi avaliada a presença de fluorescência interferente em linfócitos humanos após o tratamento com extratos de três diferentes plantas medicinais, sendo estas, objeto de estudo do nosso grupo de pesquisas. Os extratos são: o extrato etanólico das partes aéreas de Ageratum fastigiatum, extrato etanólico das partes aéreas de Eriosema campestre e o extrato etanólico do caule de Pseudobrickellia brasiliensis. Foi coletado o sangue de três voluntários para a separação das células mononucleares de sangue periférico, para a confecção de culturas in vitro em meio RPMI devidamente suplementado. Foram feitas uma cultura controle não-tratada (CON), culturas tratadas com cada extrato em três concentrações diferentes, além de uma cultura de células tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO), solvente usado na solubilização dos extratos vegetais. As culturas celulares foram incubadas por 24 horas a 37 °C e 5% de CO2. Após esse período, as células foram lavadas e avaliadas por citometria de fluxo ou por microscopia confocal. A presença de fluorescência interferente foi determinada com base em histogramas de intensidade de fluorescência feitos para oito intervalos de comprimento de onda distintos, tendo sido feitas análises quali e quantitativas dos dados. A fluorescência dos extratos vegetais e DMSO foram avaliadas isoladamente por fluorimetria, usando-se as mesmas concentrações utilizadas para as culturas celulares. Através da citometria de fluxo, foi identificado que o tratamento de linfócitos com qualquer um dos três extratos de plantas levou ao aparecimento de fluorescência interferente detectável em várias faixas de comprimento de onda. Culturas tratadas com DMSO não apresentaram fluorescência interferente. Pela fluorimetria foi visto que os extratos não emitem fluorescência, o que sugere que a fluorescência interferente foi induzida nas células após interações entre elas e os extratos. Este estudo levanta precauções que visam avaliar a possível presença de fluorescência interferente em condições de trabalho, possibilitando evitar esse viés e aumentar a confiabilidade dos resultados.
Potencial anti-inflamatório e antioxidante do extrato etanólico de raízes de Eriosema campestre var. macrophyllum (Grear) Fortunato
(UFVJM, 2021) Ottoni, Marcelo Henrique Fernandes; Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Pereira, Wagner de Fátima; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM); Melo, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de; Pereira, Wagner de Fátima; Villela, Daniel Campos; Klein, André; Kassuya, Candida Aparecida Leite; Souza, Michaelle Geralda dos Santos
Na medicina popular, preparações etanólicas das raízes da planta Eriosema campestre var. macrophyllum, são utilizadas como agente anti-inflamatório. Estudos sugerem que o extrato etanólico de suas raízes possui atividade imunomoduladora, mas seu efeito sobre a inflamação aguda é desconhecido. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico de EC-RA sobre elementos da resposta inflamatória aguda. Avaliamos a atividade antioxidante dos extratos etanólicos de partes aéreas (EC-AE) ou raízes (EC-RA) de E. campestre, pelos ensaios de Folin-Ciocauteau, de capacidade antioxidante total e de 2,2-difenil-2- picrilhidrazina (DPPH●). Realizaram-se ensaios in vitro com células RAW 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) por 24 horas. A partir de concentrações não citotóxicas obtidas pelo ensaio de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT), foi testado o efeito de EC-RA sobre a produção de TNF, IL-6 e MCP-1, por ELISA, sobre a produção de óxido nítrico (NO) pelo método de Griess e sobre a fagocitose de zimosan-FITC por microscopia confocal. Investigou-se ainda a atividade anti-inflamatória de EC-RA administrado oralmente, utilizando os modelos de edema de pata induzido por carragenina em ratos Holtzman e de inflamação pulmonar induzida em camundongos C57Bl/6J pela instilação intranasal de LPS. Observamos que EC-AE e EC-RA apresentaram quantidade de compostos fenólicos e atividade antioxidante maiores em relação ao controle do solvente. EC-RA apresentou efeito inibitório sobre a produção de IL-6 [Controle não tratado (NT): 122,5 ± 11,9 pg/ml vs. EC-RA a 40μg/ml: 69,9 ± 7,2 pg/ml, p<0,05], e sobre MCP-1 (NT: 1879 ± 125 pg/ml vs. EC-RA a 10: 1345 ± 186 pg/ml; a 20: 1286 ± 75pg/ml; e a 40μg/ml: 804 ± 86pg/ml, p<0,05). Não foi observado efeito sobre a produção de TNF ou sobre a atividade fagocítica. Células tratadas com EC-RA produziram menos NO quando comparadas à cultura NT (NT: 7,61 ± 1,62μM vs EC-RA a 10: 4,13 ± 1,02μM; 20: 2,77 ± 1,08 μM; e 40μg/ml: 2,00 ± 0,98 μM). EC-RA diminuiu o edema de pata em ratos [% inibição do edema 6h após a indução: grupo veículo (VEÍC): 20,5 ± 18,47 vs EC-RA a 430mg/kg: 60,0 ± 29,74, p<0,05], e reduziu o número de leucócitos no lavado broncoalveolar de camundongos com inflamação pulmonar (VEÍC: 520,0 ± 115,4 x 103 células/ml vs EC-RA a 430mg/kg: 221,9 ± 27,06 x 103 céls./ml). Assim, nossos resultados sugerem uma ação biológica de EC-RA sobre parâmetros da resposta inflamatória aguda, possivelmente pela inibição de IL-6, MCP-1 e NO.